黄芪三仙汤干预成骨细胞护骨素及护骨素配体的表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.006

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (11): 1939-1945.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.11.006

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黄芪三仙汤干预成骨细胞护骨素及护骨素配体的表达

黎晓敏¹，卢昌均²，周艳芳¹，周志昆¹，冯鑫¹，郑丽华¹

1广东医学院药学院，广东省东莞市 523808
2广西柳州市中医院，广西壮族自治区柳州市 545001

收稿日期:2012-07-25 修回日期:2012-08-24 出版日期:2013-03-12 发布日期:2013-03-12
通讯作者: 周志昆，博士，教授，广东医学院药学院，广东省东莞市 523808
作者简介:黎晓敏，女，1986年生，广东省江门市人，汉族，2010年广东医学院毕业，主要从事中药防治骨质疏松症研究。 zhouzhkun@126.com

Huangqi Sanxian decoction is involved in gene regulation of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand in osteoblasts

Li Xiao-min¹, Lu Chang-jun², Zhou Yan-fang¹, Zhou Zhi-kun¹, Feng Xin¹, Zheng Li-hua¹

1 School of Pharmacology, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China
2 Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Liuzhou 545001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2012-07-25 Revised:2012-08-24 Online:2013-03-12 Published:2013-03-12
Contact: Zhou Zhi-kun, Doctor, Professor, School of Pharmacology, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China zhouzhkun@126.com
About author:Li Xiao-min, School of Pharmacology, Guangdong Medical University, Dongguan 523808, Guangdong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

背景：长期临床研究表明黄芪三仙汤对骨质疏松症有一定的治疗作用，基础实验研究也表明黄芪三仙汤能改善实验动物的生物力学指标。在此基础上实验拟从细胞分子水平上探讨黄芪三仙汤对成骨细胞的相关作用。
目的：观察黄芪三仙汤对体外培养成骨细胞护骨素、护骨素配体基因调节的作用，探讨黄芪三仙汤治疗骨质疏松的作用机制。
方法：制备黄芪三仙汤和仙灵骨葆胶囊含药血清及空白血清，对体外培养新生SD大鼠成骨细胞进行干预，应用细胞形态观察、MTT、Western blot分析法及蛋白浓度测定法，观察各含药血清对体外培养成骨细胞的增殖及成骨细胞护骨素、护骨素配体表达的影响。
结果与结论：经药物干预后成骨细胞变为长梭形、条索状，融合成片，分界较为模糊，细胞生长较密集。黄芪三仙汤可明显促进成骨细胞护骨素蛋白浓度的提高(P < 0.01)，同时也提高了护骨素配体蛋白浓度(P < 0.01)，而护骨素/护骨素配体浓度比例水平明显升高(P < 0.01)。结果可见黄芪三仙汤可能是通过调节成骨细胞分化调控因子护骨素、护骨素配体的表达来调节成骨细胞的增长，从而实现其对骨质疏松症的治疗作用。

关键词: 组织构建, 骨组织构建, 黄芪三仙汤, 补肾活血, 成骨细胞, 护骨素, 护骨素配体, 骨质疏松, 细胞培养, 破骨细胞, 骨吸收, 骨形成, 省级基金, 组织构建图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Long-term clinical research has demonstrated that Huangqi Sanxian decoction exerts a certain curative effect on osteoporosis. In addition, experimental studies have also showed that Huangqi Sanxian decoction can improve the biomechanical indexes in experimental animals. The present study aimed to investigate the effect of Huangqi Sanxian decoction on osteoblasts in the cellular level.
OBJECTIVE: To observe the effects of Huangqi Sanxian decoction on gene regulation of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand in osteoblasts cultured in vitro and to investigate the action mechanism underlying the curative effect of Huangqi Sanxian decoction on osteoporosis.
METHODS: Huangqi Sanxian decoction, Xianlinggubao capsule containing serum and blank serum were prepared to intervening osteoblasts from newborn Sprague-Dawley rats cultured in vitro. Cellular morphology was observed, and western blot analysis and determination of protein concentration were used to observe the effects of drug-containing serum on osteoblast proliferation, gene expression of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand in osteoblasts cultured in vitro.
RESULTS AND CONCLUSION: After drug intervention, osteoblasts were spindle-shaped and trabs-shaped, which were concentrated and confluent with undefined boundary. Huangqi Sanxian decoction could increased the protein expression of osteoprotegerin in osteoblasts (P < 0.01), and also increased the protein expression of receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (P < 0.01) to increase ratio of osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor kappa B ligand (P < 0.01). Huangqi Sanxian decoction can achieve the therapeutic effect on osteoporosis through regulating the expression of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand.

Key words: tissue construction, bone tissue construction, Huangqi Sanxian decoction, supplementing kidney and promoting blood circulation, osteoblasts, osteoprotegerin, osteoprotegerin ligand, osteoporosis, cell culture, osteoclasts, bone resorption, bone formation, provincial grants-supported paper, tissue construction-containing paper

中图分类号:

R318

黎晓敏，卢昌均，周艳芳，周志昆，冯鑫，郑丽华. 黄芪三仙汤干预成骨细胞护骨素及护骨素配体的表达[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(11): 1939-1945.

Li Xiao-min, Lu Chang-jun, Zhou Yan-fang, Zhou Zhi-kun, Feng Xin, Zheng Li-hua. Huangqi Sanxian decoction is involved in gene regulation of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand in osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(11): 1939-1945.

图/表（结果） 9

2.1 新生SD大鼠成骨细胞形态学变化 在倒置显微镜下可以观察到，接种24 h后大部分细胞贴壁、伸展，初时细胞形态多样化，呈多边形、梭形，胞浆丰富，为单核，胞核大而清晰，呈圆形或卵圆形，含一两个核仁[4]。培养3 d后，细胞伸出较多突起，突起相互连接，细胞形态变为长梭形、条索状，融合成片，分界较为模糊。传至3代后，细胞形态仍保持长梭形、条索状，细胞形态变化不大，且各代增长速度较为接近。第3代成骨细胞经含药血清处理后，细胞密集程度比较，见图1及表1。

由图1及表1可见，黄芪三仙汤组、仙灵骨葆组与空白组相比细胞数均明显增多(P < 0.01)；总体上看，黄芪三仙汤组的细胞数增长多于仙灵骨葆组(P < 0.05)。

2.2 不同浓度黄芪三仙汤含药血清干预后成骨细胞增殖结果 从MTT分析结果可见黄芪三仙汤含药血清的浓度在1%-10%之间有一个峰，说明黄芪三仙汤含药血清的浓度在1%-10%适合成骨细胞的增长，见图2A。在适合浓度范围中再选取浓度为2%，3%，4%，6%，8%，12%浓度进行MTT分析，见图2B及表2。可见在加药后24 h，黄芪三仙汤血药浓度为12%，6%，3%比血药浓度为8%，4%，2%的细胞增殖明显增多(P < 0.01)，因此选用12%，6%，3% 3个浓度作为实验的血药浓度。

2.3 Western blot分析法观察黄芪三仙汤对第3代SD大鼠成骨细胞护骨素、护骨素配体蛋白表达的影响 见图3。根据 Western blot分析法得出的结果观察到黄芪三仙汤组、仙灵骨葆组均有护骨素、护骨素配体蛋白的表达，而空白组此两种蛋白的表达不明显。

2.4 不同浓度含药血清对第3代新生SD大鼠成骨细胞护骨素蛋白表达的影响 仙灵骨葆组和黄芪三仙汤组血药浓度3%，6%，12%与空白组血药浓度3%、6%、12%相比，护骨素蛋白表达均有明显升高，且与空白组相比差异有非常显著性意义(P < 0.01)，结果表明，黄芪三仙汤含药血清、仙灵骨葆含药血清与正常血清组相比，成骨细胞护骨素蛋白的表达明显增强。由此可以说明黄芪三仙汤含药血清与仙灵骨葆含药血清可能都是通过促进成骨细胞表达护骨素，使之与护骨素配体的结合增多，从而抑制了护骨素配体的活性，进而抑制破骨细胞的功能达到治疗骨质疏松的目的。黄芪三仙汤组血药浓度3%，6%，12%与仙灵骨葆组血药浓度3%，6%，12%相比，黄芪三仙汤组血清干预成骨细胞后护骨素表达明显较仙灵骨葆组高 (P < 0.01)，见表3。

2.5 不同浓度含药血清对第3代新生SD大鼠成骨细胞护骨素配体蛋白表达的影响 仙灵骨葆组和黄芪三仙汤组血药浓度3%，6%，12%与空白组血药浓度3%，6%，12%相比，护骨素配体蛋白浓度均有明显升高，且与空白组相比有明显差异(P < 0.01)，由此可以说明黄芪三仙汤含药血清和仙灵骨葆含药血清可能都不是通过抑制成骨细胞表达护骨素配体，抑制破骨细胞的活性，达到治疗骨质疏松的目的，见表4。

2.6 不同浓度含药血清对第3代新生SD大鼠成骨细胞护骨素/护骨素配体蛋白表达比值的影响 见表5。

由表5可见，黄芪三仙汤组、仙灵骨葆组比空白组护骨素/护骨素配体比例水平明显升高(P < 0.01)，从而得知黄芪三仙汤含药血清与仙灵骨葆含药血清可能都是通过刺激成骨细胞表达护骨素，使之与护骨素配体的结合增多，进而对破骨细胞产生抑制作用。黄芪三仙汤组血药浓度3%、6%与对照组血药浓度3%、6%相比无明显升高(P > 0.05)，黄芪三仙汤组血药浓度12%与仙灵骨葆组血药浓度12%相比总体上有升高(P < 0.05)，从而得知：黄芪三仙汤含药血清各浓度组护骨素/护骨素配体水平与仙灵骨葆含药血清各浓度组差异不明显。

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引言

材料方法

设计：分子生物学对比观察。
时间及地点：实验于2007年7月至2010年7月在广东医学院肿瘤研究实验室完成。
材料：
实验动物：新生SD大鼠10只，体质量250-300 g左右SD大鼠12只，雌雄各半，由广东医学院实验动物中心提供。
主要试剂：
Main reagents:

实验方法：
黄芪三仙汤的制备：黄芪三仙汤制剂—黄芪三仙胶囊(黄芪、威灵仙、仙茅、仙灵脾、川芎、肉苁蓉、田三七、地龙等)，由广东医学院药学院药剂实验室提供。称取黄芪三仙胶囊药粉约9.0 g，用量筒量取蒸馏水100 mL，将药粉溶解于蒸馏水中，加热搅拌，使药粉均匀分散在蒸馏水中，留待灌胃。
仙灵骨葆的制备：仙灵骨葆胶囊( 淫羊藿、续断、补骨脂、地黄、丹参、知母等)，由贵州同济堂制药有限公司生产，蒸馏水100 mL溶解约9.0 g药粉，留待灌胃。
含药血清的制备^[4]：取体质量250-300 g的SD大鼠12只，雌雄各半，随机分为3组，每组4只，即空白组(蒸馏水灌胃组)、仙灵骨葆组(仙灵骨葆灌胃组)、黄芪三仙汤组(黄芪三仙汤灌胃组)，每只大鼠每次灌胃5 mL， 3次/d，连续7 d。最后一次灌胃2 h后心脏取血，倾斜静置4 h，3 000 r/min(离心半径约13 cm)离心15 min后收集血清，56 ℃水浴灭活30 min，经0.22 μm滤膜过滤除菌分装，-20 ℃保存备用。
成骨细胞培养：参照文献[4-7]，并略作改进。取24 h内新生的SD大鼠10只，在体积分数为75%的乙醇溶液中浸泡一两分钟后，无菌条件下取颅盖骨，在PBS中剔除软组织，冲洗2次后，置于0.1%Ⅰ型胶原酶中，同时将骨片剪成1-3 mm²大小，室温振荡消化20 min后吸弃Ⅰ型胶原酶；然后将颅盖骨加入0.1%Ⅰ型胶原酶和0.25%的胰蛋白酶混合液中(0.1%Ⅰ型胶原酶∶0.25%的胰蛋白酶=2∶1)，室温振荡消化30 min，吸取上清液，加入等量含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基终止消化后，1 500 r/min(离心半径约13 cm)离心 10 min，弃掉溶液，加入含体积分数为20%小牛血清DMEM培养基，用吹打管吹打，让细胞完全悬浮在溶液中。重复以上步骤2次后，合并细胞悬液，调整细胞浓度为10⁸ L^-1，将细胞悬液吸到25 mL的培养瓶中于 37 ℃，体积分数为5%CO₂，饱和湿度下培养。细胞完全贴壁后每2 d换液1次，待细胞长满后传代。传代时，先用PBS冲洗2次，在0.25%胰蛋白酶中消化3-8 min，倒置显微镜下观察细胞皱缩变圆时加入含体积分数为10%小牛血清的DMEM培养基终止消化，用吸管吸培养基吹打瓶底，使细胞悬浮于培养基中，调整细胞浓度为10⁸ L^-1后分装入25 mL的培养瓶中继续孵育。第3代成骨细胞进行下一步实验。
含药血清干预成骨细胞：取第3代成骨细胞，25 mL/瓶，加入不同浓度的各组含药血清5 mL，放置培养箱中孵育48 h后，进行其他定量分析。
细胞形态学观察：每日通过倒置显微镜观察细胞的形态，生长状况。
MTT法测细胞增殖^[8-9]：选用生长良好的第3代成骨细胞，用0.25%胰酶消化制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×10⁷ L^-1，接种到96孔培养板中，每孔接种 100 μL细胞悬液。接种24 h后，用无血清的DMEM培养液再培养24 h，再换用含各浓度黄芪三仙汤含药血清及空白血清的DMEM培养液培养。于接种后第3，4，5天，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃继续孵育4 h终止培养，观察到各培养孔内有紫色结晶物出现，小心吸弃孔内上清液。每孔加入150 μL 二甲基亚砜，振荡 10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值，记录结果。
Western blot分析法^[10-11]：①选择第3代药物干预后的成骨细胞，用裂解液裂解细胞，收集蛋白样品并测定蛋白质浓度，计算含40 μg蛋白的溶液体积即为上样量。②电泳：制备好4 mL 12%分离胶及1.5 mL 5%浓缩胶，加样后接通电源，调节电压至100 V开始电泳，直至溴酚蓝到达分离胶底部。③转膜(Transfer)：选用聚偏二氟乙烯膜，使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为400 mA，转膜时间为60 min。④封闭(Blocking)：转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗一两分钟，以洗去膜上的转膜液；加入脱脂奶粉封闭液在摇床上缓慢摇动，室温封闭180 min后在4 ℃ 封闭过夜。⑤一抗孵育(Primary antibody incubation)和二抗孵育(Secondary antibody inucubation)。⑥蛋白检测(Detection of proteins)：参考显色剂说明书，给膜染色完成，观察结果。
主要观察指标：①含药血清干预后成骨细胞增殖情况。②含药血清干预后成骨细胞护骨素及护骨素配体蛋白表达。
统计学分析：采用SPSS 12.0软件进行统计学处理，各组间数据比较用单因素方差分析。

讨论

成骨细胞是来源于未分化间充质中的多潜能干细胞，是由具有多种形态和功能特点的细胞亚群构成，参与了骨的吸收、形成及改建。成骨细胞可分泌胰岛素样生长因子、成纤维生长因子、转化生长因子、护骨素、护骨素配体等因子影响了成骨细胞增殖、分化。骨保护因子是一种缺乏跨膜结构域的分泌性糖蛋白，在骨骼，护骨素主要由成骨细胞系和骨髓基质细胞产生。

护骨素是一种可溶性的诱饵受体，其作用是结合或中和可溶性的护骨素配基及成骨细胞/基质细胞结合的护骨素配体，竞争性阻断护骨素配体与核激活因子受体结合从而封闭成骨细胞诱导的破骨细胞前体分化、存活与融合，抑制成熟破骨细胞活化,诱导破骨细胞的凋亡^[12]。Kwan等^[13]用鼠单克隆细胞测试护骨素作用时，证实护骨素/护骨素配体在破骨细胞样细胞的骨吸收中起强大的抑制作用，并且护骨素的生理活性具有以护骨素配体依赖性。

护骨素配体是一种跨膜蛋白，由成骨细胞和激活的T细胞表达，是惟一能直接刺激破骨细胞发育和使之激活的细胞因子，它与破骨细胞表面受体护骨素配体结合，强有力的促进破骨细胞的形成、分化、成熟，并抑制破骨细胞凋亡，延长其存活。护骨素配体可增强破骨细胞运动能力并抑制破骨细胞的凋亡而间接抑制成骨细胞骨形成功能^[14]。

护骨素/护骨素配体/核激活因子受体信号传导通路直接影响了骨形成和骨吸收这两个骨代谢的基本过程，以护骨素配体和护骨素比率的平衡在骨改建中起重要的控制作用。通常情况下骨形成与骨吸收之间保持平衡，即成骨细胞与破骨细胞保持功能性偶联，但是当某种原因使这种功能性偶联破坏，骨吸收超过骨形成，骨量减少时，即可引起骨质疏松。成骨细胞和破骨细胞都是骨代谢过程中的重要核心细胞，而成骨细胞不仅参与骨形成，而且还参与破骨细胞性骨吸收的调节。有研究表明，成骨细胞能表达护骨素配体，与破骨细胞的前体细胞表面的核激活因子受体结合后，促进破骨细胞的分化及骨吸收活性；成骨细胞又可分泌护骨素与护骨素配体竞争性结合，阻止护骨素配体与核激活因子受体结合，进而抑制其骨吸收活性^[15]。

实验采用Westernblot分析法与蛋白浓度检测技术，对成骨细胞表达的护骨素、护骨素配体及护骨素/护骨素配体比例水平进行了观察。通过实验表明，黄芪三仙汤含药血清对护骨素/护骨素配体/核激活因子受体系统有明显的激活作用，其主要途径可能是一方面促进成骨细胞分泌护骨素，使之与护骨素配体的结合增多，进而使破骨细胞活性降低；另一方面使护骨素配体与核激活因子受体的结合率增加，更多地激活了破骨细胞，进而以正反馈方式激活成骨细胞，更好地使破骨细胞完成了骨的吸收功能，从而使骨形成和骨吸收达到新的动态平衡，促进了成骨细胞主导骨形成的功能，改善了骨内的微环境，达到了骨髓充足之效。由于黄芪三仙汤与仙灵骨葆的护骨素/护骨素配体比例水平差异不大，从而可知两药在对护骨素/护骨素配体/核激活因子受体重要信号传导通路作用上具有相似的作用机制，两药都是通过调节破骨细胞分化调控因子护骨素、护骨素配体的表达来实现对骨质疏松症的治疗作用。

基金资助：广东省科技计划项目(2006B35601005)。
作者贡献：实验设计为周志昆，实验实施为黎晓敏、周艳芳、冯鑫、郑丽华，实验评估为周志昆、周艳芳，资料收集为卢昌均。黎晓敏、卢昌均成文，周志昆审校，黎晓敏对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

黄芪三仙汤干预成骨细胞护骨素及护骨素配体的表达

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