牙周膜干细胞成骨分化中细胞因子的作用

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.018

摘要/Abstract

摘要：

背景：牙周膜干细胞是牙周组织中的成体干细胞，具有高度增殖、自我更新能力和多分化潜能。促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化有助于牙周疾病的治疗。
目的：观察胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2对牙周膜干细胞向成骨细胞分化的影响。
方法：采用胶原酶消化人牙周膜组织，获得牙周膜干细胞，经体外鉴定、扩增后，通过倒置显微镜、苏木精-伊红染色、流式细胞仪对牙周膜干细胞进行生物学检测。分别在成骨细胞诱导培养液中加入成骨诱导液(对照组)及胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2持续诱导7，14 d后，进行碱性磷酸酶染色、碱性磷酸酶活性检测，以及茜素红染色，并用实时定量PCR法检测向成骨细胞分化的标志性基因的表达情况。
结果与结论：胰岛素样生长因子1刺激组的碱性磷酸酶活性以及钙化结节明显高于对照组，Runx2、Alp、col-1的mRNA呈高表达；成纤维细胞生长因子2刺激组的碱性磷酸酶活性以及钙化结节也高于对照组，Runx2、Alp、col-1的mRNA表达量也高于对照组。提示胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2在不同程度上促进体外培养的牙周膜干细胞向成骨细胞方向分化。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 胰岛素样生长因子1, 成纤维细胞生长因子2, 牙周膜干细胞, 成骨细胞, 成骨分化, 软骨, 骨生长, 多分化, 钙化结节, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Periodontal ligament stem cells are the adult stem cells in periodontal tissues, which possess the ability for strong proliferation, self-renewal and multipotent differentiation. These cells can promote the osteoblast differentiation of periodontal ligament stem cells and therefore assist in treatment of periodontal diseases.
OBJECTIVE: To investigate the effects of insulin-like growth factor-1 and fibroblast growth factor-2 on osteoblast differentiation of periodontal ligament stem cells.
METHODS: Human periodontal ligament stem cells were harvested from periodontal ligament tissue by collagenase digestion. After in vitro identification, amplification and hematoxylin-eosin staining, periodontal ligament stem cells were biologically detected by flow cytometry. Then these cells were induced with osteogenic induction medium, insulin-like growth factor-1 or fibroblast growth factor-2 for 7 and 14 days. Alkaline phosphatase staining, alkaline phosphatase activity detection and alizarin red staining were performed. In addition, real-time quantitative PCR method was performed to detect the expression of marker gene of osteogenic differentiation.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared to the control group, alkaline phosphatase activity and calcified nodules were significantly greater, and Runx2, Alp, and col-1 mRNA expression was significantly higher, in the insulin-like growth factor-1 group. These findings suggest that insulin-like growth factor-1 and fibroblast growth factor-2, to different extents, promote osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells cultured in vitro.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, insulin-like growth factor-1, fibroblast growth factor-2, periodontal ligament stem cells, osteoblasts, osteogenic differentiation, cartilage, bone growth, multipotent differentiation, calcified nodules, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 6

2.1 牙周膜干细胞表面分子鉴定 通过流式细胞仪检测干细胞的特异性CD分子是鉴定干细胞最常用的方法，从而验证所培养的细胞是不是干细胞以及是否纯化。流式细胞仪的分析显示本实验分离培养的牙周膜干细胞表达干细胞相似表面分子，见图1，其中阴性表达CD14、CD34、STRO-1；阳性表达CD29、CD90均同文献报道。

2.2 牙周膜干细胞形态学改变 显微镜下观察，正常情况下所培养的牙周膜干细胞呈长梭形类似成纤维细胞，传代培养后约4 h开始贴壁，两三天进入指数生长期，细胞增殖速度较快，4-6 d进入平台期。细胞生长速度平稳，呈单层贴壁生长。在胰岛素样生长因子1组诱导培养三四天后，细胞形态由长梭形变成多角形或短棒状或椭圆形，而成纤维细胞生长因子2组的细胞形态改变不明显，见图2。

2.3 牙周膜干细胞成骨诱导后化学染色 牙周膜干细胞在对照组以及胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2诱导7 d后，进行碱性磷酸酶染色发现：胰岛素样生长因子1及成纤维细胞生长因子2组诱导的细胞染色呈紫蓝色，颜色比对照组更深，见图3。继续成骨诱导14 d后，细胞钙的沉积，茜素红染色成黑褐色，胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2诱导组比对照组较明显，见图4。

2.4 碱性磷酸酶活性检测 将对照组和实验组成骨诱导0，3，7，14 d后，碱性磷酸酶活性测定显示：胰岛素样生长因子1及成纤维细胞生长因子2诱导的牙周膜干细胞碱性磷酸酶活性均大于对照组，两者比较，差异有显著性意义(P < 0.05)。但胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2组间比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5。

2.5 PCR检测成骨基因表达变化 胰岛素样生长因子1及成纤维细胞生长因子2组和对照组成骨诱导14 d后，提取细胞总RNA，RT-PCR法检测成骨细胞标志性基因Alp、Runx2、col-1表达，结果显示胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2组均比对照组增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

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引言

材料方法

设计：组织学及细胞水平和分子水平观察。
时间及地点：于2011年7月至2012年2月在兰州大学基础医学院实验室完成。
材料：
牙周膜干细胞来源：12-15岁正常青少年临床因正畸需要拔除遗弃的前磨牙30颗，来源于兰州大学口腔医院和甘肃省人民医院。
胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2对牙周膜干细胞向成骨细胞分化实验的主要试剂和仪器：
Main experimental reagents and instruments:

方法：
牙周膜干细胞的培养：收集前磨牙用PBS冲洗后，用刀片刮取牙根中1/3牙周膜组织，将其块切成约1 mm的小块，采用酶解组织块法培养。直至有细胞从组织块边缘爬出。细胞生长达80%汇合时用胰酶消化传代培养。本实验所有检测均用3-5代牙周膜干细胞。
牙周膜干细胞表面分子鉴定：分别取培养扩增后的第3代牙周膜干细胞，经胰酶消化后，用含10 g/L牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗涤、重悬细胞，制成牙周膜干细胞浓度为5×10⁶ L^-1的单细胞悬液，分别加入Eppendorf管中，每管200 μL(1×10⁶个细胞)，再分别加入小鼠抗大鼠CD14、CD34、CD29、CD90、STRO-1各2 μL和同型对照流式抗体，4 ℃避光孵育60 min，用含体积分数3%FBS的PBS清洗3遍并重悬细胞(4 ℃离心，离心半径12.5 cm，5 min，1 000 r/min)。流式细胞仪检测，Cell-Quest软件分析。
牙周膜干细胞向成骨细胞的诱导分化和化学染色：取3-5代牙周膜干细胞，细胞传代后以1×10⁷ L^-1的细胞浓度接种于24孔培养板内，培养至细胞达到融合70%-80%以上时，更换成骨诱导液。实验分为3组：①对照组：培养液含有体积分数10%胎牛血清的成骨诱导液(含体积分数10%FBS的α-MEM培养基，地塞米松10-7 mol/L，抗坏血酸Vc 50 mg/L，β-甘油磷酸钠 10 mmol/L)。②胰岛素样生长因子1组：在含有体积分数10%胎牛血清的成骨诱导液中加入质量浓度为 25 μg/L的胰岛素样生长因子1。③碱性成纤维细胞生长因子2组：在含有体积分数10%胎牛血清的成骨诱导液中加入浓度为0.5 nmol/L 的小鼠碱性成纤维细胞生长因子2。
碱性磷酸酶染色成骨诱导7 d后，加入One-Step^TMNBT/BCIP溶液(PIERCE)染色，相差显微镜下拍照。
茜素红染色：观察到细胞复层生长且细胞外出现不透光的黑色结节，继续培养，至 21 d时弃上清，常规清洗、风干，加入茜素红染色，置于CO₂培养箱中孵育20 min，弃茜素红，PBS冲洗2遍，相差显微镜下拍照。
碱性磷酸酶活性定量测定：将对照组和实验组牙周膜干细胞按1×10⁷ L^-1细胞浓度接种于96孔板，分别在诱导后3，7，14 d后弃去培养液，常规清洗后，参照试剂盒说明书，加0.3%Triton X-100 100 μL，37 ℃孵箱孵育4 h时，加碱性磷酸酶试剂100 μL，37 ℃孵箱孵育1 h，震荡15 min，每组细胞设置5个副孔，3个空白对照孔，选择405 nm波长的酶标仪检测A值。
RNA提取以及实时定量PCR：RNA的分离提取，收集各组成骨诱导14 d的牙周膜干细胞，按TRIzol试剂说明书进行细胞总RNA提取。按TaqMan试剂盒要求2 μg RNA被反转录成cDNA，PCR反应条件：95 ℃ 45 s，94 ℃ 45 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35个循环，72 ℃延伸10 min。用SYBR Green Mater Mix试剂检测待测的基因mRNA水平，共重复检测3次，mRNA水平用β-actin作内参，基因的表达用△△Ct法定量分析^[5]。
牙周膜干细胞mRNA基因引物序列：
Gene primer sequences of periodontal ligament stem cells:

主要观察指标：分别将25 μg/L 胰岛素样生长因子1和0.5 nmol/L 成纤维细胞生长因子2加入到培养牙周膜干细胞的成骨细胞诱导培养液中，持续诱导7，14 d后，观察两种因子加入后对牙周膜干细胞向成骨细胞分化的影响。
统计学分析：实验数据均以x(_)±s表示，显著性检验采用双侧检验，P < 0.05表示差异有显著性意义，所有结果计算采用SPSS 15.0进行检验分析。

讨论

牙周膜干细胞是在干细胞理论和技术发展较为成熟的基础上提出的。牙周膜干细胞具有分化形成牙槽骨、牙骨质和牙周膜的潜能，在牙周生理、病理和牙周病再生治疗中发挥极其重要的作用^[6-9]。

目前国内外对于牙周膜干细胞的研究处于刚刚起步阶段，大部分的研究主要集中在其多向分化潜能及分离纯化，关于牙周膜干细胞应用于临床的相关报道更是很少。大量研究表明：生长因子通过调节细胞活性和细胞间信号传递直接或间接调节骨细胞的分化增殖及功能，从而调控骨改建^[10-13]。实验所选的胰岛素样生长因子1的主要功能是调节机体出生后的生长^[14-16]。另一个因子已有实验证明成纤维细胞生长因子2与成骨细胞表面受体相结合后，促进骨细胞和类骨细胞的有丝分裂，同时对成骨细胞的表型特征和细胞外基质的基因表达发挥调控作用。然而在成纤维细胞生长因子2诱导骨髓基质细胞的分化实验中，结果也不一致^[17-19]。

实验首次探讨了胰岛素样生长因子1及成纤维细胞生长因子2是否影响牙周膜干细胞在体外的成骨能力。在成骨诱导液中，实验组牙周膜干细胞比对照组牙周膜干细胞显示更大的茜素红阳性面积，并且其钙化结节比正常对照组大、着色深，这表明被胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2诱导的牙周膜干细胞有更强的成骨能力。实验结果被定量RT-PCR和碱性磷酸酶活性进一步证实。定量RT-PCR结果显示实验组牙周膜干细胞Runx-2，成骨前体细胞分化的标志Col-1的表达较对照组高。碱性磷酸酶在矿化组织形成过程中有重要作用，碱性磷酸酶常作为牙源性的间充质干细胞向成牙骨质/成骨表型分化的早期标志之一^[20-23]。由此可以看出胰岛素样生长因子1和成纤维细胞生长因子2参与并促进了牙周膜干细胞成骨分化的全过程。实验显示，尽管成纤维细胞生长因子2刺激不仅对细胞形态的改变不明显，而且碱性磷酸酶活性升高，成骨细胞的特异性表达基因的表达量的升高都不如胰岛素样生长因子1明显，但在一定程度上是促进牙周膜干细胞向成骨细胞分化。

然而任何单一的因子都不能靠单独发挥作用而完全实现理想的牙周再生，在今后的研究中必须考虑综合因素的影响。

致谢：感谢基础医学院的各位老师在细胞培养及实验中给予的帮助和支持！感谢兰州大学医院口腔医院全体老师对我学习、科研和临床工作的热心支持和帮助。
作者贡献：第二作者进行实验设计，第一作者进行实施，第三作者进行实验评估，第二作者收集资料，第一作者成文，通讯作者审校，第一作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验得到所在单位的伦理委员会批注。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

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