改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.014

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (10): 1793-1800.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.10.014

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改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞

别利克孜·卡德尔¹，刘奕杉¹，王璇¹，李伯琦¹，马艳¹，毕晓娟¹，努斯来提·哈里克²

1 新疆医科大学第一附属医院儿牙预防保健科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
2 新疆吉木萨尔县人民医院口腔科，新疆维吾尔自治区吉木萨尔县 831700

收稿日期:2012-08-09 修回日期:2012-10-29 出版日期:2013-03-05 发布日期:2013-03-05
通讯作者: 刘奕杉，硕士，副主任医师，新疆医科大学第一附属医院儿牙预防保健科，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054 lys-tree@126.com
作者简介:别利克孜?卡德尔★，女，1986年生，新疆维吾尔自治区昌吉市人，维吾尔族，新疆医科大学第一附属医院在读硕士，主要从事儿童口腔医学，乳牙牙髓干细胞方面的研究。 bilikz@163.com

Isolation and culture of dental pulp stem cells from human deciduous teeth by modified enzyme digestion

Bielikezi·kadeer¹, Liu Yi-shan¹, Wang Xuan¹, Li Bo-qi¹, Ma Yan¹, Bi Xiao-juan¹, Nusilaiti·halike²

1 Department of Prevention and Health Care of Children’s Teeth, First Affiliated Hospital of Xinjiang
Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
2 Department of Stomatology, People’s Hospital of Jimsar County, Jimsar 831700, Xinjiang Uygur
Autonomous Region, China

Received:2012-08-09 Revised:2012-10-29 Online:2013-03-05 Published:2013-03-05
Contact: LiuYi-shan, Master, Associate chief physician, Department of Prevention and Health Care of Children’s Teeth, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054,Xinjiang Uygur Autonomous Region, China lys-tree@126.com
About author:Bielikezi?kadeer★, Studying for master’s degree, Department of Prevention and Health Care of Children’s Teeth, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China bilikz@163.com
Supported by:
新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2011211A067)。

摘要/Abstract

摘要：

背景：乳牙牙髓干细胞具有极强的增殖活力，可以在短期内获得组织工程需要的细胞量。
目的：比较传统酶消化法和改良酶消化法获取人乳牙牙髓干细胞的成功率及生物学特性。
方法：取无龋滞留乳切牙12 颗，随机数字表法均分为两组，分别应用传统酶消化法和改良酶消化法分离获取乳牙牙髓细胞，在不同代次细胞中检测细胞扩增天数、收获量、生长曲线、倍增时间、克隆形成率、细胞表面特异标记物STRO-1、CD146、CD34 和CD45 的表达。细胞成骨、成脂诱导分化能力及通过检测碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白表达水平，判定细胞牙向分化潜能。
结果与结论：两组细胞生长曲线，扩增天数、细胞收获量及细胞倍增时间相比，差异有显著性意义(P <0.05)；牙向分化实验结果显示，改良酶消化法碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白较传统酶消化法和对照组而言呈强阳性表达。然而，两组在克隆形成率、细胞表面特异标记物及多项诱导分化等方面差异无显著性意义(P > 0.05)。说明改良酶消化法与传统酶消法相比，可在较短时间内完成同源乳牙牙髓干细胞体外扩增培养，可为牙齿再生治疗提供高质量种子细胞，是乳牙牙髓干细胞体外培养的可靠方法。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 乳牙牙髓细胞, 改良酶消化法, 牙本质涎蛋白, 体外培养, 细胞鉴定, 牙向分化, 省级基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Dental pulp stem cells from human deciduous teeth greatly proliferate and cell number required by tissue engineering can be easily acquired within a short time period.
OBJECTIVE: To compare the cell harvest success rate and biological characteristics of dental pulp stem cells from human deciduous teeth between conventional enzyme digestion and modified enzyme digestion.
METHODS: Twelve caries-free deciduous incisors were selected in this study. Dental pulp stem cells were harvested from these human deciduous teen by conventional enzyme digestion method (n=6 incisors) and modified enzyme digestion method (n=6 incisors). Cell expansion days, total cell harvest, growth curves, cell doubling time, cell colony formation rate, cell surface specific markers STRO-1, CD146, CD34 and CD45 were determined among different generations of cells. Osteogenic and adipogenic differentiation of cells were determined by detecting alkaline phosphatase and dentin sialoprotein expression levels.
RESULTS AND CONCLUSION: There were significant differences in growth curves, cell expansion days, total cell harvest and cell doubling time between conventional enzyme digestion and modified enzyme digestion (P <0.05). Alkaline phosphatase and dentin sialoprotein expression levels were significantly higher in dental pulp stem cells cultured by modified enzyme digestion than by conventional enzyme digestion method. However, there were no significant differences in cell colony formation rate, cell surface specific marker expression and induced cell differentiation between modified enzyme digestion and conventional enzyme digestion (P > 0.05). Compared to conventional enzyme digestion, modified enzyme digestion can assist in in vitro expansion and culture of dental pulp stem cells from homologous deciduous teeth within a short time period and provide high-quality seed cells for tooth regeneration and is a reliable method for in vitro culture of dental pulp stem cells from deciduous teeth.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, deciduous tooth dental pulp cells, modified enzyme digestion, dentin sialoprotein, in vitro culture, cell identification, odontogenic differentiation, provincial grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

别利克孜·卡德尔，刘奕杉，王璇，李伯琦，马艳，毕晓娟，努斯来提·哈里克. 改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(10): 1793-1800.

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引言

材料方法

讨论

乳牙牙髓干细胞具有很强的自我更新和多向分化的潜能^[8]。目前，乳牙牙髓干细胞的分离培养已经进入了很成熟的阶段，常用的培养方法有组织块法和酶消化法。Gronthos等^[9]首次将中性蛋白酶dispase与Ⅰ型胶原酶联合应用消化人牙髓组织，获得增殖力强、克隆形成率高并有分化潜能的具备干细胞特性的细胞群；但蒋俊强^[10]等研究发现，细胞经长时间或高浓度酶消化作用后可破坏细胞表面的蛋白质，直接影响细胞的生物学活性，以致细胞生长缓慢，难以成功传代。李昊妍^[11]应用组织块法收集乳牙牙髓干细胞操作简便，由于乳牙牙髓组织量较少，扩增足够临床治疗剂量的细胞数耗时长，需两三周，以往的研究为了获得足够的治疗细胞数^[12]，收集多个供者的多颗滞留乳牙牙髓细胞进行体外扩增，这样在临床再生、修复的移植治疗中无疑增加了免疫排斥和疾病交叉感染的风险，并受到伦理的限制。因此，实验将常规酶消化法和组织块法的优势进行整合，改良了传统的酶消化法，以单个供体来源的滞留乳牙为研究对象，在体外进行培养扩增，明确改良消化法对乳牙牙髓干细胞的增殖特性和生物学特性的影响。

为明确改良酶消法与传统酶消法对细胞生物学的影响差异，本实验用传统酶消化法获得单细胞悬液，6例样本中仅有2例接种后细胞生长良好，12 d后进行首次传代，培养成功率仅为33.3%；而改良酶消化法培养组织块72 h后即可见细胞从组织块中游出，约9 d后就可进行首次传代，其培养成功率可达67.7%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)。结果证明传统酶消化法培养的细胞受到消化酶的直接作用，对细胞膜黏附分子和结构蛋白造成了不同程度的损害，致使细胞的粘附性降低，接种细胞的恢复期(潜伏期)延长，降低了培养的成功率。而改良后的酶消法，不仅可使致密组织块疏松化，又可减少细胞与酶的直接接触，这种良好的保护作用使得组织块游出的细胞以较短的潜伏期快速进入群体倍增期，并且细胞的群体倍增时间短于传统的酶消法，表明改良酶消法获得的细胞不仅增殖能力强，而且增殖速度快。细胞的克隆形成率却没有明显改变，但很多研究都表明乳牙牙髓干细胞具有较高的增殖率^[13]。

许诺等^[14]研究提示，体外分离细胞至P3后细胞形态趋于一致，可被有效纯化。而源于乳牙的牙髓细胞较成体牙髓细胞有更多的早期细胞^[15]。因此，实验选择体外培养至P3细胞为检测对象，经体外扩增培养P3后，细胞形态上大多数体积较小，类似于成纤维样细胞呈长梭形；少数为多角形或椭圆形，细胞折光性强，核呈大的卵圆形，着色深，可见部分分裂相细胞，胞浆着色浅，与许诺等的研究的结果一致。

Laino等^[16]研究表明在体外培养中，乳牙牙髓干细胞可形成三维编织骨样结构，推测乳牙牙髓干细胞具有潜在骨形成能力，而乳牙牙髓干细胞的诱导分化水平，取决于受诱导剂的物质成分，还可与体内外微环境的变化及诱导时间密切相关。牙本质涎蛋白是一种牙本质非胶原蛋白^[17]，有研究还证明牙本质涎蛋白不仅是牙本质矿化所必需的非胶原蛋白，而且诱导间充质干细胞分化为成牙本质样细胞的重要因子。碱性磷酸酶是常用的矿化鉴定指标^[18-19]，也参与牙本质的形成，细胞经矿化液诱导培养后，其碱性磷酸酶活性与矿化结节的形成能力存在正相关[20]。实验为明确乳牙牙髓干细胞的牙向分化能力，通过检测碱性磷酸酶、矿化结节形成、牙本质涎蛋白的表达证明改良酶消化法经过短时间酶解后，能保留细胞原有的成牙本质细胞分化能力和生物学活性。

目前，牙源性成体干细胞的鉴定和分选多采用STRO-1，CD146等的检测^[21-22]。郑颖等^[23]研究将细胞进行有限稀释法纯化，获得的单克隆细胞的STRO-1检测率达到76.4%，Pivoriūnas等^[24]研究表明在人乳牙牙髓组织中，STRO-1主要定位于血管壁和神经束膜，有研究还表明，STRO-1阳性细胞群落表现出高度的增殖活力以及多向分化的潜能^[25]。CD146是一种细胞膜糖蛋白和内皮细胞黏附分子，主要表达于正常的间质组织，而造血细胞不表达。造血干细胞的表面标志物如CD34、CD45等表达很弱，其表达与其他间充质来源的干细胞表面标志表达高度类似。实验为明确从人乳牙牙髓获得的细胞具有间充质干细胞的特性，对两种方法获得的细胞进行了STRO-1和CD146的检测，均为阳性表达，并且改良酶消法均略高于传统酶消法，但低于单克隆来源的乳牙牙髓干细胞(76.4%)。

综上所述，改良酶消化法可从一个供体的脱落乳牙的微量组织中高效的扩增乳牙牙髓干细胞，从而在为临床自体移植修复、再生牙齿治疗的同时，又最大限度的降低了免疫排斥和疾病交叉感染的风险，是体外分离培养乳牙牙髓干细胞又一可靠的的培养方法。

致谢：首先要感谢我的导师刘奕杉副教授。刘老师在选题、科研设计、实验研究等各方面给予了我悉心的指导。感谢王璇老师渊博的知识、严谨的科研态度为我留下了深刻的印象，感谢李伯琦老师为我提供标本。衷心感谢新医大一附院医学研究中心干细胞实验室的毕晓娟和马艳老师，马老师和毕老师在实验干细胞方面给予了我悉心的指导和莫大的帮助。感谢实验室的师兄、师姐、师弟、师妹。
基金资助：新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2011211A067)。
作者贡献：通讯作者进行实验设计，第一作者进行实施，第二和第四作者进行实验评估，标本收集为第三作者，第一作者成文，通讯作者申校，通讯作者对文章负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：实验不涉及伦理学内容。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞

Isolation and culture of dental pulp stem cells from human deciduous teeth by modified enzyme digestion

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