脂肪干细胞介导的自体脂肪移植隆胸

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.018

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (5): 878-885.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.018

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脂肪干细胞介导的自体脂肪移植隆胸

闫俊灵¹, ²，狄国虎¹，丁红¹，张巍¹，刘嘉琦¹，汤苏阳¹

1 武装警察部队总医院皮肤再生医学科，北京市 100039
2 辽宁医学院，辽宁省锦州市 121000

收稿日期:2012-08-12 修回日期:2012-10-26 出版日期:2013-01-29 发布日期:2013-01-29
通讯作者: 汤苏阳，博士，主任医师，武装警察部队总医院皮肤再生医学科，北京市 100039 tangsuyang@hotmail.com
作者简介:闫俊灵★，女，1986年生，北京市人，汉族，辽宁医学院在读硕士，医师，主要从事再生医学-创伤修复方面的研究。 53193228@qq.com

Auto-adipose stem cells facilitate autologous fat transfer for breast augmentation

Yan Jun-ling¹, ², Di Guo-hu¹, Ding Hong¹, Zhang Wei¹, Liu Jia-qi¹, Tang Su-yang¹

1 Skin Regeneration Medicine, General Hospital of Armed Police Forces, Beijing 100039, China
2 Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China

Received:2012-08-12 Revised:2012-10-26 Online:2013-01-29 Published:2013-01-29
Contact: Tang Su-yang, Doctor, Chief physician, Skin Regeneration Medicine, General Hospital Armed Police Forces, Beijing 100039, China tangsuyang@hotmail.com
About author:Yan Jun-ling★, Studying for master’s degree, Physician, Skin Regeneration Medicine, General Hospital of Armed Police Forces, Beijing 100039, China; Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, Liaoning Province, China 53193228@qq.com

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂肪干细胞具有多向分化潜能，在组织工程和再生医学领域具有广阔的应用前景。
目的：随访评估脂肪干细胞在自体脂肪移植隆胸中的技术要点及治疗效果。
方法：随访15例自体脂肪颗粒注射隆胸患者3-6个月。脂肪移植隆胸过程分为两期，一期用于脂肪干细胞的分离与扩增，抽出脂肪量为10-20 mL。用胶原酶Ⅰ消化，贴壁培养获得脂肪干细胞，扩增至第2代达到1×108，并进行细胞免疫表型，分化及遗传稳定性鉴定。二期抽取脂肪量300-450 mL，脂肪混合脂肪干细胞用于移植填充。
结果与结论：第2代自体脂肪干细胞具有典型的间充质干细胞的特征，移植后3-6个月回访无明显脂肪吸收现象，无感染、疼痛、上肢活动受限等不良反应，隆胸效果良好。作者认为自体脂肪干细胞介导的自体脂肪注射隆胸是一种切实可行有效的方法。

关键词: 器官移植, 组织移植, 组织细胞移植, 脂肪干细胞, 间充质干细胞, 遗传稳定性, 免疫表型, 分化潜能, 隆胸, 自体脂肪颗粒注射, 器官移植细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Human adipose stem cells have the capability of multipotential differentiation and have a promising prospect in the field of tissue engineering and regenerative medicine.
OBJECTIVE: To evaluate the technology and efficacy of human adipose stem cells in autologous fat grafting breast augmentation.
METHODS: Fifteen patients with auto-adipose injection breast augmentation were followed-up for 3-6 months. The whole operation was separated into two phases, in the first phase, 15-20 mL adipose tissue was aspirated and digested with collagenase Ⅰ to separate and amplify the human adipose stem cells. When cultured to passage 2, the plastic adherent stem cells were up to 1×108 and verificated by immunophenotype, differentiation and genetic stability assays before transplantation. In the second phase, 300-450 mL adipose tissue was aspirated and transplanted combined with human adipose stem cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The passage 2 human adipose stem cells exhibited typical mesenchymal stem cells characteristics and maintained genetic stability. The 3-6 months follow-up demonstrated that there was no apparent adipose absorption, infection, pain and upper limb activity limitation, and the effect was good. The authors suggested that autologous adipose derived stem cells-mediated auto-adipose injection breast augmentation is a practical and efficacious method.

Key words: organ transplantation, tissue transplantation, tissue and cell transplantation, adipose derived stem cells, mesenchymal stem cells, genetic stability, immunophenotype, differentiation potential, breast augmentation, auto-adipose injection, photographs-containing paper of organ transplantation

中图分类号:

R318

闫俊灵，狄国虎，丁红，张巍，刘嘉琦，汤苏阳. 脂肪干细胞介导的自体脂肪移植隆胸[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(5): 878-885.

Yan Jun-ling, Di Guo-hu, Ding Hong, Zhang Wei, Liu Jia-qi, Tang Su-yang. Auto-adipose stem cells facilitate autologous fat transfer for breast augmentation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(5): 878-885.

图/表（结果） 10

2.1 脂肪干细胞形态观察 接种后24 h，倒置显微镜下观察，大部分细胞已经贴壁，成梭形。同时混有少量未贴壁的圆形淋巴细胞，见图1。

接种48 h后，换液将淋巴细胞去除，待细胞长满后，见图2，细胞呈现旋涡状生长。

脂肪干细胞传至第2代，未见形态上有任何差异，见图3。

2.2 脂肪干细胞免疫表型鉴定结果 流式细胞仪检测显示：第2代脂肪干细胞高表达CD29，CD44，CD73，HLA-ABC，阳性率均大于95%；但不表达内皮标志CD31，CD14，造血细胞表面标志物CD34，CD45以及Ⅱ类主要组织相容性抗原HLA-DR，阳性率低于3%，见图4。

2.3 脂肪干细胞多向分化及遗传稳定性 第2代脂肪干细胞经成脂诱导培养基诱导8 d后，细胞变圆，油红O染色后显示细胞内有大量脂滴生成，见图5。

在加入成骨诱导培养基3周后，碱性磷酸酶染色显示大量成骨细胞生成，见图6。显示第2代脂肪干细胞具有多向分化潜能。

染色体分析报告显示第2代脂肪干细胞染色体的形态、结构和数目均未见异常，呈二倍体结构，说明其核型是稳定的，见图7。

2.4 纳入15例患者移植后回访分析 15例脂肪干细胞介导自体脂肪移植隆胸患者随访3-6个月，30侧乳房各项指标中术者评价优良率和受术者满意率分别为：乳房形态87%，柔软度93%，乳头乳晕感觉100%，双上肢活动功能100%。与文献[5]中假体移植组相比，有明显优势，见图8和表2。

2.5 脂肪干细胞介导自体脂肪移植后的不良反应 15例受试患者植入自体脂肪后均无感染，疼痛，上肢活动受限等不良反应。

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引言

隆胸又称隆乳或丰胸，是通过植入医用材料或移植自身组织，使乳房体积扩大、形态丰满匀称，改善女性体型、恢复女性特有曲线美的一种手术。从医学的角度来说，隆胸本身不属于高难复杂的手术，而隆胸的发展与进步，归根结底是在于隆胸材料的进步与发展^[1-2]。从19世纪80年代初，隆胸先后经历了液体石蜡注射隆胸，硅油、硅胶假体乳房植入等，但由于其相关并发症，包括挛缩、变形、变硬、渗漏、手感不自然等问题一直困惑着求医者和医生^[3-4]。特别是2004年聚丙烯酞胺水凝胶(奥美定)被发现其在人体内分解成剧毒单体分子，毒害神经系统，损伤肾脏，对生命循环系统造成伤害，给近百万受害者生理上和心理上造成了巨大的伤害，目前被中国国家药监局全面叫停^[5]。因此，寻找安全、有效、无毒、持久的组织代用品成了隆胸发展的关键，当人们意识到自体脂肪有可能成为丰乳的材料时，立即受到求医者和施术者的欢迎，并赋以了极大期望。自体脂肪注射隆胸，从19世纪末开始进入临床，由于其手感自然、创口小、技术的不断改进成熟，接受手术治疗者日益增多。然而自体脂肪注射隆胸的成败与否和脂肪细胞的成活率有关，脂肪组织注射后存在吸收等问题，因此常常需要多次手术，并且有液化感染等并发症难题^[6-7]。

在作者近期的研究工作中，如何筛选用于移植的脂肪颗粒，脂肪颗粒移植后转归的病理生理，存活足够量(体积)的脂肪，和避免脂肪坏死的纤维囊性化是取得疗效和进一步发展的关键。脂肪干细胞具有多分化潜能，是组织工程和再生医学理想的种子细胞^[8]。采用的脂肪干细胞介导的自体脂肪移植隆胸，是结合具有分化成脂肪细胞潜能的，且遗传稳定性的自体脂肪间充质干细胞，能明显提高移植脂肪细胞的成活率^[9]。实验通过对15例隆胸患者进行随访，评价该技术的术后效果，证实采取的自体脂肪干细胞混合脂肪微粒共同移植的隆胸方法，能有效地抑制移植脂肪的吸收、感染、坏死，促进移植脂肪组织的血管再生，乳房成形效果好

材料方法

对象和方法
设计：体外细胞分离培养鉴定与患者随访分析。
时间及地点：实验于2010年10月至2011年12月在武警总医院皮肤再生科完成。
对象：纳入对象15例，均为女性，年龄23-45岁，健康状况良好，无其他系统性疾病，
隆胸前均签订知情同意书，并经武警总医院伦理委员会通过。
纳入标准：①原发性乳房发育不良，胸部扁平。②妊娠后的自发性乳房萎缩。③乳腺组织病变或外伤后的乳房发育不良。④乳房两侧不对称或有轻度下垂者。⑤纳入患者自愿参加实验，并签署知情同意书。
排除标准：①心理准备不足者。②乳房组织有炎症或手术切口附近有皮肤炎症者。③患有精神分裂症或精神异常者。④心、肝、肾等重要脏器有病变者。⑤患有免疫系统或造血系统疾病者。⑥乳房癌术后复发或有转移倾向者。
脂肪干细胞介导自体脂肪移植隆胸的主要试剂及仪器：
Main reagents and instruments used in the experiment of adipose derived stem cells-mediated auto-adipose injection for breast augmentation:

实验方法：
自体脂肪干细胞的分离培养：在隆胸第一期，于患者上下腹处抽取30-40 mL脂肪与生理盐水混合物(包含脂肪量10-20 mL)，加入生理盐水离心2次，去除麻醉剂及血细胞，取上层脂肪层，加入0.075% Ⅰ型胶原酶于 37 ℃恒温摇床消化60 min，离心半径13.5 cm， 1 500 r/min，离心15 min，去除上层脂肪组织，沉淀用生理盐水重悬，100 μm细胞筛过滤，去除残余结缔组织，再次离心，离心半径13.5 cm，1 500 r/min，离心5 min，加入红细胞裂解液，裂解5 min，用生理盐水清洗两遍，计数，用α-MEM培养基以10⁹L^-1铺于培养皿中。记为P0代，待细胞长满后，0.05%胰蛋白酶消化，按照1∶6的比例传代。传至第2代做鉴定及移植。
脂肪干细胞免疫表型鉴定：取第2代间充质干细胞，胰酶消化后，PBS清洗2遍，分别标记小鼠抗人CD14-PE，CD29-PE，CD31-PE，CD34-PE，CD44-PE，CD45-FITC，CD73-PE，HLA-ABC-FITC，HLA-DR- FITC单抗，对照管加入小鼠lgG抗体，室温避光孵育 30 min，PBS清洗2次，流式细胞仪检测。
分化潜能鉴定：取第2代间充质干细胞，参照文献[8]，加入成脂、成骨诱导培养基，诱导结束时，分别用油红O和碱性磷酸酶染色试剂盒鉴定。
遗传稳定性鉴定：取第2代间充质干细胞，参照文献[9]，做常规涂片，Gimsa染色，油镜下观察，分析。
脂肪干细胞介导脂肪微粒移植：二期吸脂同一期，吸脂量为350-400 mL，脂肪注射针头用外径2 mm的不锈钢针，在乳房基底部4个象限8点及乳晕外缘，在脂肪层和腺体后注入脂肪颗粒，均匀地注入注射针头，边注射边退出。本实验共15例，两侧乳房分别注入最小量187 mL，最大量为420 mL。之后将提取好的脂肪干细胞摇匀，使之呈悬浮状态，在原注射位点注入脂肪干细胞，每侧乳房注入细胞量达8×10⁷。注入后乳房作适当塑形，移植完毕两侧乳房用弹性绷带轻加压包扎固定。
细胞移植后乳房形态学评价标准：见表1。

主要观察指标：脂肪干细胞的细胞形态，分化潜能，遗传稳定性，病例移植后3-6个月回访及评价。
统计学分析：第一作者采用SPSS 13.0软件处理，组之间比较采取One-way ANOVA方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，具有在体内组织修复与重建的功能^[10-11]。自Zuk 等[12]2001年成功从脂肪组织分离出干细胞并命名为脂肪间充质干细胞，脂肪干细胞得到极大关注，与骨髓来源的间充质干细胞相比，脂肪干细胞储量更加丰富，取材更加方便，痛苦小，干细胞扩增能力更强，因此脂肪干细胞是组织工程的理想种子细胞^[13]。最近的研究证明，脂肪干细胞可以向中胚层的脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞分化，也可以向心肌细胞，胰岛细胞，肝脏细胞分化，表明了脂肪干细胞的多向分化潜能^[14-18]。

与其他传统隆胸方式相比，单纯的脂肪颗粒注射移植具有以下优点^[19-20]：①无排斥反应：无包膜挛缩，乳房变硬。②移植后恢复快：微小创伤，无须住院。③移植后针眼痕迹不明显，乳房手感好，乳晕乳头皮肤感觉无异常，无乳头勃起差或不能勃起之虞。但是也存在着：吸收、液化、多次注射移植、移植脂肪细胞的成活率低，乳房成形受限，尤其对皮下脂肪量比较少的求美者更甚^[21-22]。

实验采用的脂肪干细胞介导的自体脂肪移植隆胸，是结合具有分化成脂肪细胞潜能的，且遗传稳定性的自体脂肪间充质干细胞，明显提高移植脂肪细胞的成活率，促进移植脂肪的血管再生，较单纯的脂肪颗粒注射移植能减少手术次数(一次移植即可)，减少脂肪颗粒吸收、液化、感染等并发症，提高脂肪微粒的存活，乳房成形效果好等优点^[23-24]，可能与以下4个原因有关。

脂肪干细胞具有分化成脂肪细胞的能力^[25]，注入的脂肪干细胞约能单次增加脂肪细胞的移植数量2×108，15例患者移植后3个月回访均无明显回缩，乳房外形满意率87%。

脂肪干细胞具有分泌细胞因子、基质的能力，可以促进移植脂肪颗粒的血管再生，增强移植的脂肪颗粒细胞的稳定，同时脂肪干细胞以脂肪颗粒细胞为模板进行增殖^[26]，接种后24 h，倒置显微镜下观察，大部分细胞已经贴壁，成梭形。同时混有少量未贴壁的圆形淋巴细胞，接种48 h后，换液将淋巴细胞去除，待细胞长满后，细胞呈现旋涡状生长。

脂肪干细胞分泌的细胞因子、基质及乳房的局部环境诱导自体脂肪间充质干细胞向脂肪细胞、血管内皮细胞、乳房腺体细胞分化^[27]，第2代脂肪干细胞在成脂诱导培养基诱导8 d后，细胞变圆，油红O染色后显示细胞内有大量脂滴生成。在加入成骨诱导培养基3周后，碱性磷酸酶染色显示大量成骨细胞生成。脂肪干细胞可以以移植入体内的脂肪颗粒细胞为支架，在其周围聚积，分化成脂肪细胞及自体脂肪间充质干细胞^[28-30]。

总之，实验结果显示脂肪干细胞介导的自体脂肪移植隆胸具有微创、移植脂肪成活率高、乳房成形效果好等优点。

作者贡献：实验由通讯作者设计，全部作者参与实施，第一作者完成评估与总结，所有作者均通过系统培训，未采用盲法评估。文章由第一作者负责。
利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。
伦理要求：参与实验个体对实验过程完全知情同意，在充分了解本治疗方案的前提下签署“知情同意书”，实验方案获医院伦理委员会批准。
医生资质：实验实施医生从事临床工作均在10年以上、职称在副主任医师以上，经过相关培训、同类手术既往完成30例次以上，成功率100%。
作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。

脂肪干细胞介导的自体脂肪移植隆胸

Auto-adipose stem cells facilitate autologous fat transfer for breast augmentation

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