肾移植后排斥与感染中细胞免疫功能的监测

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (5): 811-816.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.05.008

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肾移植后排斥与感染中细胞免疫功能的监测

王庆华，尚乐乐，谌泰春，王瑾，唐敏英，吴琳，谭建明

解放军南京军区福州总医院泌尿外科，福建省福州市 350025

收稿日期:2012-07-18 修回日期:2012-10-10 出版日期:2013-01-29 发布日期:2013-01-29
通讯作者: 谭建明，博士生导师，解放军南京军区福州总医院泌尿外科，福建省移植生物学重点实验室，福建省福州市 350025 tanjm156@yahoo.com.cn
作者简介:王庆华，女，1963年生，福建省福州市人，汉族，2001年解放军第三军医大学医学检验专业学校毕业，主要从事移植免疫学研究。Wqhua6310@yahoo.com.cn
基金资助:
福建省科技创新平台建设计划(2010Y2006)

Immune function monitoring for rejection and infection after renal transplantation

Wang Qing-hua, Shang Le-le, Chen Tai-chun, Wang Jin, Tang Min-ying, Wu Lin, Tan Jian-ming

Department of Urinary Surgery, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China

Received:2012-07-18 Revised:2012-10-10 Online:2013-01-29 Published:2013-01-29
Contact: Tan Jian-ming, Doctoral supervisor, Department of Urinary Surgery, Provincial Key Laboratory of Transplant Biology, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China tanjm156@yahoo.com.cn
About author:Wang Qing-hua, Department of Urinary Surgery, Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Command of PLA, Fuzhou 350025, Fujian Province, China Wqhua6310@yahoo.com.cn
Supported by:
the Scientific Innovation platform Construction Plan of Fujian Province, No.2010Y2006

摘要/Abstract

摘要：

背景：Cylex ImmuKnow检测方法是惟一得到FDA认可的检测移植受者细胞免疫功能的方法, 它直接反映细胞免疫的功能，具有灵敏度高、特异性强，结果量化等优点。
目的：通过对肾移植后患者监测细胞免疫功能iATP值(intracellular adenosine triphosphatei)，分析细胞免疫功能与肾移植术后排斥或感染的关系。
方法：140例肾移植受者采用ImmuKnowTM-Cylex®方法检测细胞免疫功能，收集数据结合患者临床状态分为排斥组18例，感染组35例与稳定组87例，同时收集61份健康人群血样检测细胞免疫功能数据作对照。分析细胞免疫功能与肾移植患者移植后发生排斥与感染的关系。
结果与结论：细胞免疫功能iATP值检测结果显示，感染组患者有71.4%(n=25)分布在低免疫区，同比对照组、稳定组与排斥组比例明显增高(P < 0.05)。感染组iATP值显著低于其他3组。说明感染与细胞免疫功能低下两者具有明显的相关性，细胞免疫功能测定对监测肾移植后感染具有显著意义。提示ImmuKnowTM-Cylex®方法测定细胞免疫功能为肾移植后并发感染的诊断与治疗提供可靠客观依据，但与肾移植后排斥反应的发生未见明显的相关性，有待于大样本的实验证实。

关键词: 器官移植, 肾移植, 细胞免疫功能, 免疫, 细胞免疫, 排斥反应, 感染, iATP值, ImmuknowTM, 省级基金

Abstract:

BACKGROUND: Cylex ImmuKnow is the first and only U S Food and Drug Administration-cleared blood test to measure immune cell function, it can reflect the immune function of the cells directly, which is a valuable tool with good qualities of high sensitivity and specificity.
OBJECTIVE: To investigate the correlation between immune cell function and the rejection and infection after renal transplantation through monitoring of immune function intracellular adenosine triphosphatei value.
METHODS: We collected 140 renal transplant patients. The immune cell function levels were measured by ImmuKnowTM-Cylex®. The patients were divided into three groups according to clinical status of patients, namely, rejection group (n=18), infection group (n=35) and stability group (n=87). In addition, the cellular immune function data in the blood of 61 samples from healthy people were collected as control group. Then the correlation of the immune cell function and infection to rejection after renal transplantation was analyzed.
RESULTS AND CONCLUSION: The measurement of intracellular adenosine triphosphatei value showed that about 71.4% (n=25) patients in the infection group distributed in the low immune response zone, and the percentage in the infection group was significantly higher than that in the other three groups (P < 0.05). The intracellular adenosine triphosphatei value in the infection group was significantly lower than that in the other three groups. That indicated that the infection was correlated with low cellular mediated immune function, and the detection of immune cell function played an important role in monitoring the infection after renal transplantation. The immune cell function monitoring with ImmuKnowTM-Cylex® assay provides reliable and objective basis for the diagnosis and treatment of infection after renal transplantation, but it has no correlation with the rejection after renal transplantation, and that needs further investigation with a large-sample experiment.

Key words: organ transplantation, renal transplantation, immune cell function, immune, cell immune, rejection, infection, intracellular adenosine triphosphatei value, ImmuknowTM, provincial grants-supported paper

中图分类号:

R318

王庆华，尚乐乐，谌泰春，王瑾，唐敏英，吴琳，谭建明. 肾移植后排斥与感染中细胞免疫功能的监测[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(5): 811-816.

Wang Qing-hua, Shang Le-le, Chen Tai-chun, Wang Jin, Tang Min-ying, Wu Lin, Tan Jian-ming. Immune function monitoring for rejection and infection after renal transplantation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(5): 811-816.

图/表（结果） 3

2.1 参与者数量分析纳入患者140例，健康者61人，按意向性处理分析，全部进入结果分析。

2.2 肾移植各组患者及对照者细胞免疫功能iATP值分布情况移植患者与健康人群的iATP值分别分布在4.56-855.42 μg/L和51.2-590.8 μg/L之间。其中，感染患者有71.4%(n=25)在低免疫区(iATP<225 μg/L)；同比稳定组、排斥组和健康对照组所占比例(分别为34.5%，22%和19.7%)明显增高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表1。

2.3 肾移植各组患者及对照者iATP值单向方差LSD法组间多重比较分析见图1。

图1 肾移植各组患者及对照者iATP值单向方差LSD法组间多重比较分析结果

Figure 1 Multiple comparison results of the intracellular adenosine triphosphatei (iATP) value analyzed with one-way variance least significant difference method

感染组iATP值和移植后稳定组间差异有显著性意义[(154.55±127.35)，(336.23±166.26) μg/L，P < 0.001]，并且感染组与健康对照组间差异也存在显著性意义[(154.55±127.35)，(350.28±116.76) μg/L，P < 0.001]；iATP值在排斥组和移植后稳定组间差异无显著性意义[(367.35±160.90)，(336.23±166.26) μg/L，P > 0.05]，和对照组间差异也无显著性意义[(367.35± 160.90)，(350.28±116.76) μg/L，P > 0.05)]，

敏感性分析ROC曲线下面积为0.833(95%置信区间为0.756-0.911，P < 0.001，见图2)；在iATP<225 μg/L的患者中监测感染的灵敏度为0.729，特异度为0.714，说明细胞免疫功能测定对监测术后感染具有显著意义，见图2。

图2 肾移植后患者iATP值敏感性分析ROC曲线

Figure 2 Receiver operating characteristic curve of intracellular adenosine triphosphatei (iATP) value sensitive analysis in patients with renal transplantation

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引言

材料方法

设计：分组对照观察。

时间及地点：患者资料来源于2008年3月至2010年12月解放军南京军区福州总医院器官移植中心。

对象：本组肾移植患者140例。其中男76例占54.3%，女性64例占45.7%，年龄22-67岁。群体反应性抗体(PRA)均为阴性，淋巴细胞毒试验均<5%。本组140例分为4组：移植后发生排斥的患者为排斥组18例、移植后发生感染的患者为感染组35例、移植后病情稳定的患者为稳定组87例，另外收集61份健康人群作对照。移植后感染组受者分别于移植后15-60 d发生感染，均有发热和白细胞增高，经胸片或病原学检查证实为感染；排斥反应组受者分别于移植后14-330 d发生排斥反应，均有尿少和血肌酐升高，经病理穿刺活检诊断为移植肾急性排斥反应。肾移植患者移植后均定期随访。

纳入标准：①接受肾脏移植手术。②肾移植后应用免疫抑抑制剂后发生感染。③肾移植后发生排斥反应。

排除标准：①非肾移植手术。②未使用免疫抑抑制剂发生感染。

方法：

免疫抑制方案：本组病例移植后均采用免疫抑制剂三联用法，即环孢素或他克莫司+霉酚酸酯(MMF)+激素，药物剂量根据临床状态、体质量及全血药物浓度值进行调整。

细胞免疫功能测定方法：按照ImmuKnow^TM-Cylex^®试剂盒说明书操作^[2]。检测步骤：ImmuKnow^TM-Cylex检测主要有三大步骤，即细胞刺激、CD4⁺ T淋巴细胞的选择和ATP释放、ATP测量。孵育孔板分别加入25 μL样本稀释液和刺激液(各4孔)，再各加入1∶4稀释的样本血液100 μL，在37 ℃恒温、体积分数为5% CO₂条件下孵化15-18 h。加入CD4⁺ 磁珠液5∶1，室温孵育15 min 2次，洗涤3次后，分离出CD4⁺ T淋巴细胞，加人裂解试剂200 μL，振荡5 min，转移50 μL至测量孔板，并加人发光试剂150 μL，10 min内用计算机Data Analysis Calculator V2.2软件判读数据，分析结果。

免疫状态分区：根据iATP值的高低，将免疫状态分为3个区域^[3]：强免疫区(iATP>525 μg/L)；正常免疫区(iATP：525-225 μg/L)；低免疫区(iATP<225 μg/L)。

主要观察指标：对照组及肾移植后患者细胞免疫功能iATP值。

统计学分析：采用SPSS 16.0软件对样本进行单向方差分析及ROC曲线分析。

讨论

在临床上，医生通常根据肾移植患者的临床情况结合组织配型结果、移植肾质量和临床并发症的风险因素综合考虑制定不同的免疫治疗方案及临床用药量方案^[4]，还无法应用客观的免疫指标来评价患者的免疫状态，从而制定后的免疫抑制剂治疗方案，也无法客观地监控移植后排斥和感染的发生、发展与转归。目前，用于评估细胞免疫的体外实验方法有：测量细胞活性信号、淋巴细胞增殖、细胞毒性试验等方法，这些方法存在价格较贵、监测程序繁琐、检测时间长等缺点，在临床应用上受到一定的限制^[5]。

ImmuKnow^TM-Cylex^®是通过美国FDA认可的快速检测细胞免疫功能方法^[6-7]，通过体外测定CD4⁺T淋巴细胞对植物血凝素刺激的反应的强弱，通过荧光检测系统测定细胞内增加的ATP值(intracellular adenosine triphosphatei，iATP)，来表达机体免疫的状态^[8-9]。ATP在细胞活化过程中扮演重要角色，免疫细胞活化过程中需要ATP提供能量，通过测定细胞内的ATP值来评估细胞免疫功能^[10-12]。CD4⁺T淋巴细胞在介导抗感染和抗排斥反应的免疫中处于核心地位，它通过分化成不同的亚型来介导移植排斥反应和体液免疫反应。研究表明CD4⁺T淋巴细胞活化后可以促使B淋巴细胞增殖分化并产生抗体，与体液免疫相关^[13]。因此测定CD4⁺T淋巴细胞的活化程度能准确表达机体的免疫状态^[14]。Hooper 等^[3]学者通过该方法测得的ATP值设定成人细胞免疫参考范围：iATP>525 μg/L(强免疫力)；iATP：225- 525 μg/L(免疫力适中)；iATP<225 μg/L(较弱的免疫力，容易发生感染)。

实验结果显示，肾移植后稳定组iATP为(336.23± 166.26) μg/L；感染组iATP为(154.55±127.35)μg/L；排斥组iATP为(367.35±160.90)μg/L；正常人对照组iATP为(350.28±116.76) μg/L，感染组与稳定组和对照组iATP值差异有非常显著性意义(P < 0.001)，差异有显著性意义。感染组iATP值有71.4%分布在低免疫力范围与其他各组相比，P < 0.05，说明感染与细胞免疫功能低下两者具有明显的相关性。ROC曲线下面积为0.833 (95%置信区间为0.756-0.911，P < 0.001)提示细胞免疫功能测定对监测肾移植后感染具有显著意义，能为免疫抑制剂治疗提供客观依据。排斥组与稳定组间没有明显差异(P > 0.05)。考虑原因有以下两点：①临床样本依从性差，患者一旦出现排斥反应，就采取了相应的治疗，收集未经干预的排斥样本有一定的难度。②在排斥过程中某些患者CD4⁺/CD8⁺比例倒置。在健康人对照组，有19.7%(n=12)的人群接近或者低于225 μg/L水平(其中<100 μg/L占1.6%，n=1)，结果与之前相关报道接近^[15]，推测这部分人群对植物血凝素刺激是否存在天然耐受，具体结论待进一步研究。

国内外相关文献报道，ImmuKonw^TM检测方法具有简便易操作、灵敏度高、特异性强等临床其他方法所无可比拟的优势，能较为客观地反映移植患者的免疫状态^[4-5,10]。研究表明，当移植受者被巨细胞病毒、EB病毒以及肝炎病毒等感染时，细胞介导的免疫力下降^[16]，其外周血免疫细胞的ATP浓度也随之下降。目前应用于肝、肾、心脏、肺脏等多种器官移植监测^[17-27]。ImmuKnow^TM-Cylex^®不推荐作为预示感染与排斥的发生指标^[28-29]，但可作为监测免疫状态和制定免疫治疗方案的重要依据之一^[30]。

综上所述，ImmuKnow^TM-Cylex^®是目前用于实体器官移植后监测患者免疫状态的快速方法，它的监测在对于肾移植并发感染具有较好的临床意义，对指导感染后免疫抑制剂的个体化用药也具有参考价值，从而有效提高肾移植的人/肾存活率及生活质量。

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Immune function monitoring for rejection and infection after renal transplantation

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