3D打印微小颗粒骨/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架材料的物理性能及其生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1641

摘要/Abstract

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文题释义：
熔炉沉积型3D打印：1988年，由美国学者Scott Crump成功研发了这项3D打印技术，是利用高温将打印材料融化成液态，通过3D打印机喷头挤出后固化，在三维空间上排列形成立体实物的打印技术。实验将聚乳酸-羟基乙酸共聚物与兔同种异体微小颗粒骨按5∶1混匀，首先制成直径为0.75 cm的3D打印线材，然后将solidworker软件设计的支架模型和cura软件设计的打印方式与3D打印机连接，按调节模式在X、Y轴上实现立体打印叠加成型，制得所需3D打印复合支架。
聚乳酸-羟基乙酸共聚物：由乳酸和羟基乙酸两种单体随机聚合而成，是一种可降解的功能高分子有机化合物，按乳酸/羟基乙酸2种单体比例不同，其性能以随之变化，比例为1∶1聚合而成的聚乳酸-羟基乙酸共聚物具有最大限度无规结构，水分子渗透快，因此降解速率较其他比例快；此外其降解产物为乳酸和羟基乙酸，自身及降解产物均无生物毒性，且易于成膜、成囊，在美国其已通过FDA认证，被作为药用辅料正式收入美国药典。

背景：3D打印技术为制备具有高度个性化、精确调控孔隙率和孔径大小及孔径间连通率的理想骨组织工程支架提供了希望。
目的：利用熔炉沉积型3D打印技术制备微小颗粒骨/聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合可吸收支架，分析其物理性能和生物相容性。
方法：利用熔炉沉积型3D打印技术制备微小颗粒骨/聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合可吸收支架，检测支架的孔隙率、吸水率、水接触角及体外降解率。①细胞毒性实验：分别以正常培养基(阴性对照组)、复合可吸收支架浸提液(实验组)培养兔脂肪间充质干细胞，培养1，3，5，7 d，采用CCK-8法检测细胞增殖；②溶血实验：将兔抗凝血分别加入生理盐水、蒸馏水及复合可吸收支架浸提液中，50 min后检测溶血率；③急性毒性实验：将生理盐水、复合可吸收支架浸提液分别经腹腔注入兔体内，观察兔一般情况及重要脏器病理改变。
结果与结论：①复合可吸收支架的孔隙率为(60.86±2.88)%，吸水率为(53.98±2.04)%，水接触角为(76.27± 0.34)°；②体外浸泡于PBS中4周内，复合可吸收支架材料降解相对较慢，支架形态稳定，4周后降解速度加快，11周左右支架基本完全吸收，是一种相对理想的可吸收支架材料；③实验组与阴性对照组培养不同时间点的细胞增殖无差异(P > 0.05)，复合可吸收支架的细胞毒性为1级；④复合可吸收支架的溶血率为3.8%，小于5%，符合生物医用材料溶血率要求；⑤注射可吸收支架浸提液72 h内，兔未出现急性中毒反应表现，并且注射7 d后未见肝、心、肾等毒性病理改变；⑥结果表明，利用熔炉沉积型3D打印技术制备的微小颗粒骨/聚乳酸-羟基乙酸共聚物复合可吸收支架，具有良好的物理性能与生物相容性。

ORCID: 0000-0001-7572-2217(张敏波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 3D打印, 熔炉沉积型, 骨组织工程, 同种异体微小颗粒骨, 聚乳酸-羟基乙酸共聚物, 可吸收生物材料, 可吸收支架

Abstract:

BACKGROUND: 3D printing technology provides possibility for the preparation of an ideal bone tissue engineering scaffold with high individualization, precise regulation of the porosity, pore size and inter-aperture connectivity.

OBJECTIVE: To study the physical properties and biocompatibility of allogeneic bone microparticle/poly(lactic-co-glycolic acid) composite absorbable scaffolds fabricated via fused deposition modeling 3D printing.

METHODS: 3D printed bone microparticle/poly(lactic-co-glycolic acid) composite absorbable scaffolds were fabricated via fused deposition modeling. The porosity, water absorption, water contact angle and in vitro degradation rate of the scaffold were measured. (1) Cytotoxicity test: Rabbit adipose-derived mesenchymal stem cells were cultured in normal medium (negative control group) and composite scaffold extract (experimental group) for 1, 3, 5, 7 days, and cell counting kit-8 was then used to detect cell proliferation. (2) Hemolysis test: Rabbit anti-clotting was added to physiological saline, distilled water and composite scaffold extract, and the hemolysis rate was detected after 50 minutes. (3) Acute toxicity test: The physiological saline and composite scaffold extracts were intraperitoneally injected into the rabbits respectively to observe the general condition of rabbits and the pathological changes of important organs.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) The porosity, water absorption and water contact angle of the composite scaffold were (60.86±2.88)%, (53.98±2.04)% and (76.27±0.34)°, respectively. (2) After in vitro immersion in PBS for 4 weeks, the absorbable composite scaffold degraded relatively slowly, and the scaffold morphology remained stable, while the degradation rate accelerated after 4 weeks. The scaffold was almost completely absorbed at about 11 weeks, and it is a relatively ideal absorbable scaffold material. (3) There was no difference in cell proliferation between the experimental group and the negative control group at different time points (P > 0.05). The cytotoxicity of the absorbable composite scaffold was grade 1. (4) The hemolysis rate of the absorbable composite scaffold was 3.8%, which met the hemolytic requirement of biomedical materials (the hemolysis rate of less than 5%). (5) Within 72 hours after injection of absorbable scaffold extract, the rabbits showed no acute toxic reaction, as well as no pathological changes in the liver, heart and kidney were observed after 7 days of injection. (6) To conclude, the 3D printed allogeneic bone microparticle/poly(lactic-co-glycolic acid) fabricated via fused deposition modeling 3D printing has preferable physical properties and biocompatibility.

Key words: Biocompatible Materials, Materials Testing, Tissue Engineering

中图分类号:

张敏波，彭齐峰，马亚萍，孔维军，廖文波. 3D打印微小颗粒骨/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架材料的物理性能及其生物相容性[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(14): 2215-2222.

Zhang Minbo, Peng Qifeng, Ma Yaping, Kong Weijun, Liao Wenbo. Physical properties and biocompatibility of 3D printed bone microparticle/poly(lactic-co-glycolic acid) scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(14): 2215-2222.

图/表（结果） 9

2.1 复合支架的制备过程、形态及电镜扫描结果通过取兔四肢各管状骨，并经脱脂、脱蛋白处理后制得小片状骨块，再经球磨仪制研磨、500目筛网过滤、溶解、离心、冷冻干燥制得骨粉颗粒，将所得微小颗粒骨与PLGA按1∶5比例混合后，通过线材挤出机制得直径0.75 cm的均匀3D打印线材，线材制备过程见图1。

将线材通过熔炉沉积型3D打印技术成功制备成直径为10 mm×高2 mm的圆柱形多孔兔同种异体微小颗粒骨/ PLGA复合生物支架，电镜扫描结果示3D打印复合支架呈多孔状，内部结构成均匀层状排列，孔隙均匀，相互连通，见图2。

2.2 复合支架的孔隙率、吸水率、水接触角及体外降解率该复合支架的孔隙率为(60.86±2.88)%，吸水率为(53.98± 2.04)%，水接触角为(76.27±0.34)°，见图3。体外测定该复合支架0，2，4，6，8，10，11周的质量损失率分别为0%，3.40%，9.10%，41.40%，68.80%，92.00%，100%，11周内该复合支架基本完全吸收，其降解率曲线，见图4，表明该支架材料于4周内体外降解相对较慢，支架形态稳定，4周后体外降解速度加快，11周左右支架基本完全吸收，是一种相对理想的可吸收支架材料。

2.3 脂肪间充质干细胞的培养及CCK-8毒性实验结果实验成功获得P3代兔脂肪间充质干细胞，见图5；CCK-8实验结果显示，实验组培养1，3，5，7 d的细胞A值与阴性对照组比较无差异(P > 0.05)，见图6。实验组培养1，3，5，7 d的细胞相对增殖率分别为97.9%，99.1%，99.8%，98.9%，评价该支架材料细胞毒性1级，支架材料无明显细胞毒性，安全合格。

2.4 溶血实验结果实验组和阴性对照组均无明显溶血现象发生，阳性对照组出现明显溶血现象，见图7。复合支架材料的溶血率为3.8%，小于5%，符合生物医用材料溶血率要求，见表1。

2.5 急性毒性实验所有实验兔子腹腔注射复合支架浸提液后12，24，48，72 h后均未出现毒性反应表现，且注射后7 d内无惊厥、瘫痪、死亡等急性中毒表现，所有兔精神状态较好，饮食、睡眠、呼吸、尿便功能、体温均无异常表现。

注射浸提液7 d时处死所有实验兔，取心、肝、肾组织行苏木精-伊红病理染色切片，结果显示实验组心、肝、肾组织病理表现与对照组相同，各组织细胞结构无空泡、细胞水肿、坏死溶解等异常急性中毒性改变，见图8，证明该材料动物体内相容性良好，无明显体内毒性，为安全生物材料。

参考文献

[1] 金灿,陈振琦.应用3D打印技术制作组织工程支架:修复骨缺损的研究回顾[J].中国组织工程研究,2017,21(10):1611-1616.

[2] 周思佳,姜文学,尤佳.骨缺损修复材料:现状与需求和未来[J].中国组织工程研究, 2018, 22(14):2251-2258.

[3] Lomas R,Chandrasekar A,Board TN.Bone allograft in the U.K.: perceptions andrealities.Hip Int. 2013;23(5):427-433.

[4] Kuroda S,Katayama A,Takano -Yamamoto T.Severe anterior open-bite case treated using titanium screw anchorage.Angle Orthod.2004;74(4):558-567.

[5] Yuan J,Zhen P,Zhao HB,et al.The preliminary performance study of the 3D printing of a tricalcium phosphate scaffold for the loading of sustained release anti-tuberculosis drugs.Mater Sci.2015;50(5):2138-2147.

[6] Zhang Z,Zhang R,Song Z.Skull defect reconstruction based on a new hybrid level set. Biomed Mater Eng. 2014;24(6): 3343-3351.

[7] Guarino V,Ambrosio L.Temperature-driven processing techniques for manufacturing fully interconnected porous scaffolds in bone tissue engineering.Proc Inst Mech Eng H. 2010;224(12):1389-1400.

[8] 谢光友,杨海涛,吕富荣,等.兔脂肪间充质干细胞的培养鉴定及体外磁标记MR成像[J].第三军医大学学报,2014,36(15):1567-1571.

[9] 国家技术监督局发布.中华人民共和国国家标准GB/T 1568-1997[M].北京:中国标准出版社,1997.

[10] Sears NA,Dhavalikar PS,Seshadri D,et al.A Review of Three-Dimensional Printing in Tissue Engineering.Tissue Eng Part B Rev.2016;22(4):298-310.

[11] 周晓,盛小伍,曾勇.骨组织工程的研究进展和面临的问题[J].组织工程与重建外科杂志,2016,12(5):319-321.

[12] Turnbull G,Clarke J,Picard F,et al.3D bioactive composite scaffolds for bone tissue engineering. Bioact Mater. 2018;3(3): 278-314.

[13] Lee M,Wu BM.Recent advances in 3D printing of tissue engineering scaffolds.Methods Mol Biol.2012;868:257-267.

[14] 林楷丰,何树,宋岳,等.无丝3D打印技术常温构建仿生人工骨支架的研究[J].中华创伤骨科杂志,2016, 18(5):421-427.

[15] Akbarzadeh R,Yousefi AM.Effects of processing parameters in thermally induced phase separation technique on porous architecture of scaffolds for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res B Appl Biomater.2014;102(6):1304-1135.

[16] Murphy SV,Atala A.3D bioprinting of tissues and organs.Nat Biotechnol.2014;32(8):773-785.

[17] Nguyen DT,Mccanless JD,Mecwan MM,et al.Balancing mechanical strength with bioactivity in chitosan-calcium phosphate 3D microsphere scaffolds for bone tissue engineering: air-vs. freeze-drying processes.J Biomater Sci Polym Ed.2013;24(9):1071-1083.

[18] Wu C,Luo Y,Cuniberti G,et al.Three-dimensional printing of hierarchical and tough mesoporous bioactive glass scaffolds with a controllable pore architecture, excellent mechanical strength and mineralization ability.Acta Biomater. 2011;7(6): 2644-2650.

[19] Nakayama Y,Takewa Y,Sumikura H,et al.In-body tissue - engineered aorticivalve(Biovalve type VII) architecture based on 3D printer molding.J Biomed mater Res B ApplBiomater. 2015;103(1):1-11.

[20] 武成聪,王芳,荣树,等.3D打印应用在骨组织工程研究中的特点与进展[J].中国组织工程研究,2017, 21(15):2418-2423.

[21] Fafenrot S,Grimmelsmann N,Wortmann M,et al. Three-Dimensional (3D) Printing of Polymer-Metal Hybrid Materials by Fused Deposition Modeling. Materials(Basel). 2017;10(10):1199.

[22] Rosenzweig DH,Caredli E,Steffe T,et al.3D PrintedABS and PLA Scaffolds for Cartilage and NucleusPulposus Tissue Regeneration.Int J Mol Sci.2015;16(7):15118-15135.

[23] Cao T,Ho KH,Teoh SH.Scaffold design and in vitro study of osteochondralcoculture in a three-dimensional porous polycaprolactone scaffold fabricated by fused deposition modeling. Tissue Eng.2003;9 Suppl 1(supplement 1):S103.

[24] 彭齐峰.3D打印骨粉聚乳酸骨组织工程支架的实验研究[D].遵义:遵义医学院,2018.

[25] 钱科宏.PLGA介导的多功能复合医用材料的制备及其性能研究[D].扬州:扬州大学,2016.

[26] An G,Zhang WB,Ma DK,et al.Influence of VEGF/BMP-2 on the proliferation and osteogenetic differentiation of rat bone mesenchymal stem cells on PLGA/gelatin composite scaffold. Eur Rev Med Pharmacol Sci.2017;21(10):2316-2328.

[27] Piao S, Kim IG,LeeJY,et al.Therapeutic effect of adipose-derived stem cells and BDNF-immobilized PLGA membrane in a rat model of cavernous nerve injury.J sex Med. 2012;9(8):1968-1979.

[28] Blokhuis TJ,Lindner T.Allograft and bone morphogenetic proteins: an overview.Injury. 2008;39(9):S33-S36.

[29] 龙志成,宋兴华,龙仕杰,等.脂肪干细胞复合HA/β-TCP与同种异体骨修复兔脊柱骨缺损的比较[J].中国矫形外科杂志, 2018, 26(2): 164-169.

[30] 瞿卫,丁铃,顾龙殿,等.小颗粒同种异体骨微创植骨治疗四肢骨缺损[J].中国骨与关节损伤杂志,2017, 32(9):1000-1001.

[31] Zolnik BS,Burgess DJ.Effect of acidic pH on PLGA microsphere degradation and release.J Control Release. 2007;122(3):338-344.

[32] Yang Y,Yang S,Wang Y,et al.Anti-infective efficacy, cytocompatibility and biocompatibility of a 3D-printed osteoconductive composite scaffold functionalized with quaternized chitosan.Acta Biomater.2016;46:112-128.

[33] Liu C,Li Y,Wang J,et al.Improving Hydrophilicity and Inducing Bone-Like Apatite Formation on PPBES by Polydopamine Coating for Biomedical Application.Molecules. 2018;23(7): 1643.

[34] Wilson CJ,Clegg RE,Leavesley DI,et al.Mediation of biomaterial-cell interactions by adsorbed proteins: a review. Tissue Eng.2005;11(2):1-18.

[35] Hirasawa M,Tsutsumiarai C,Takakusaki K,et al. Superhydrophilic co-polymer coatings on denture surfaces reduce Candida albicans adhesion-An in vitro study.Arch Oral Biol.2017;87:143.

[36] Zhang P, Hamamura K, Yokota H.A brief review of bone adaptation to unloading.Genomics Proteomics Bioinformatics. 2008;6(1):4-7.

[37] 周晓,盛小伍,曾勇.骨组织工程的研究进展和面临的问题[J].组织工程与重建外科杂志,2016,12(5):319-321.

[38] Rezwan K,Chen QZ,Blaker JJ,et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering.Biomaterials.2006;27(18):3413-3431.

[39] Liu Z,Ji J,Tang S,et al.Biocompatibility, degradability, bioactivity and osteogenesis of mesoporous/macroporous scaffolds of mesoporous diopside/poly(L-lactide) composite.J R Soc Interface.2015;12(111):20150507.

[40] Watson BM, Kasper FK, Engel PS,et al.Synthesis and characterization of injectable, biodegradable, phosphate- containing,chemically cross-linkable, thermoresponsivemacromers for bone tissue engineering. Biomacromolecules.2014;15(5):1788-1796.

[41] Arrigoni E,de Girolamo L,Di Giancamillo A, et al. Adipose-derived stem cells and rabbit bone regeneration: histomorphometric, immunohistochemical and mechanical characterization. J Orthop Sci.2013;18(2):331-339.

[42] Tevlin R,Walmsley GG,Marecic O,et al. Stem and progenitor cells: advancing bone tissue engineering.Drug Deliv Transl Res.2016;6(2):1-15.

引言

材料方法

1.1 设计材料及动物对比实验。

1.2 时间及地点实验于2017年10月至2018年8月在遵义医学院-罗切斯特大学联合骨科研究中心完成。

1.3 材料

实验动物：4月龄新西兰健康大白兔，雌雄不拘，体质量(3.0±0.5) kg，购于重庆腾鑫生物技术有限公司，许可证号：scxk(渝)2017-0010。

实验主要材料、仪器及试剂：3D打印机(JOYE-2020M 湖北嘉一三维高科股份有限公司)；Wellzoom线材螺杆挤出机(深圳市米达科技有限公司)；倒置相差显微镜(日本Olympus公司)；CO₂恒温培养箱(美国 Thermo Fisher scientific公司)；酶标仪(芬兰Thermo Fisher scientific Oy)；VEGA 3 SBU扫描电镜仪(中国捷克tescan公司)；真空冷冻干燥机(美国ThermoFisher公司)；接触角测量仪(上海中晨数字技术设备有限公司)；DME/F-12培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(加拿大GIBCO公司)；CCK-8试剂盒(日本 DOJINDO公司)；PLGA(济南岱罡生物科技有限公司)；Ⅰ型胶原酶(加拿大GIBCO公司)；红细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 3D打印微小颗粒骨/PLGA复合支架的制备取健康新西兰大白兔4只，按4 mL/kg腹腔注射水合氯醛麻醉。麻醉生效后耳缘静脉注射空气处死，取四肢长管状骨(肱骨、尺桡骨、股骨、胫腓骨)，咬骨钳去除各骨端松质骨，充分刮除骨膜及附着筋膜组织，骨锤将管状骨捣成小片状，彻底清除髓腔内骨髓组织，制备好后用超纯水清洗5遍，转移至锥形瓶中，用甲醇脱脂48 h，再用体积分数30%过氧化氢脱蛋白48 h，用超纯水清洗10遍，将脱脂、脱蛋白处理所得骨组织放入45 ℃恒温烘箱中干燥48 h，彻底烘干后取出骨组织，放入研钵内研磨成小颗粒状，再放入球磨仪内，按频率30 r/s、5 min/次进行10次研磨，获得粉末状骨粉。再将骨粉溶解于高压蒸汽灭菌的超纯水中，500目筛网过滤，将滤过液装入50 mL离心管中，1 000 r/min离心 4 min，吸出多余的上清液后，按每管1.5 mL装入2 mL离心管中，封口膜封闭，1 mL注射器在封口膜上穿刺均匀小孔，-80 ℃冰箱冻结24 h。取出冻结的骨粉，放入真空冷冻干燥机中干燥24 h，获得小于500目的微小颗粒骨。

将PLGA用球磨仪研磨成粉状后，与微小颗粒骨按质量比5∶1混匀，通过线材挤出机在110 ℃条件下制备成直径为0.75 cm的3D打印线材，将solidworker软件设计的支架模型和cura软件设计的打印切片方式与3D打印机连接，调节好打印模式，即打印喷头温度180 ℃、热床温度 40 ℃、打印速度50 mm/s，并按层厚为0.1 mm在X、Y轴上实现立体打印叠加成型，制得所需3D打印复合支架。

1.4.2 复合支架的扫描电镜观察首先将检测室湿度用除湿机控制在75%以下，打开电镜扫描仪电源，然后将支架表面进行镀金处理，放入电镜扫描仪检测孔，抽真空，样品室压力为9.0×10^-2 Pa和镜筒压力在7.1×10^-2 Pa时，增加电压后旋转观察，当电压由7 000 V增加到10 000 V进行观察并采集图像。

1.4.3 复合支架的孔隙率及吸水率测定将检测样品称干质量，记为m₁，然后放入装有蒸馏水的活塞瓶内，封口膜封闭，5 mL注射器进行抽真空，观察材料表面无气泡冒出，此时蒸馏水即完全渗透进入材料空隙中，保留真空状态2 h后取出样品，用滤纸吸干材料表面的水分，称其质量记为m₂，根据公式计算孔隙率ε=(m₂-m₁)/ρ_水πR²L× 100%，其中R为该支架半径，L为支架高度，π≈3.14，再根据公式(m₂-m₁)/m₂×100%计算该支架材料吸水率，测5个支架，取平均值。

1.4.4 复合支架的水接触角检测将检测支架样本放在试样台上，将3 μL蒸馏水喷射在待测支架样本上，使液体成液滴状悬垂在支架样本上，调节显微镜焦距，拍摄液滴悬垂在支架表面照片，通过计算机内程序计算出支架材料表面接触角，每个样本取3组数据，测5个标本，取平均值。

1.4.5 复合支架的体外降解率测定取3D打印复合支架，称干质量，记录为m₁，称量后将材料放入到装有5 mL PBS (pH=7.4)的活塞瓶内，用5 mL注射器抽真空让支架完全浸润，并将瓶置于37 ℃恒温箱内进行降解，每周更换一次PBS，分别于0，2，4，6，8，10，11周时取出，UP水冲洗5次，冻干后称其质量，记录为m₂，计算其质量损失率并绘制降解率曲线。计算公式为质量损失率=(m₂-m₁)/m₁× 100%，测量5个支架，取平均值。

1.4.6 兔脂肪间充质干细胞的体外提取、传代及培养参照文献[8]提取、培养兔脂肪间充质干细胞方法。取健康新西兰大白兔1只，按4 mL/kg水合氯醛腹腔麻醉后，腹股沟区清洁备皮，碘伏消毒3次，铺无菌巾后，体积分数75%乙醇再次消毒术区后，取双侧腹股沟区脂肪组织，放入培养皿内，用含有1%青-链霉素的PBS溶液清洗3次，然后迅速转移到超净工作台内，将所得脂肪组织放入到含有体积分数10%胎牛血清、1%双抗的培养液的培养皿内，用眼科剪将肉眼所见筋膜及血管彻底去除，并将其剪成糜状后放入50 mL离心管内，加入3倍体积新鲜配置的含1%Ⅰ型胶原酶溶液，37 ℃恒温水浴箱中消化50 min，每10 min进行一次手工摇晃，使其充分消化加入等体积培养液终止消化，300目筛网过滤，将所得滤过液以1 000 r/min离心10 min，丢弃上清，再加入5 mL红细胞裂解液裂解红细胞5 min，再次1 000 r/min离心5 min，弃上清液，用含体积分数10%胎牛血清培养液吹打沉淀，制备成均匀细胞悬液接种到 25 cm²的培养瓶中后置于37 ℃、体积分数为5%CO₂、95%湿度的培养箱中培养，24 h后半换液，后每24 h换液1次。

将长满瓶底的原代兔脂肪间充质干细胞用PBS清洗2次，加入2 mL 0.25%胰蛋白酶进行消化4 min，800 r/min离心5 min，弃上清，细胞计数后重悬进行细胞传代培养，直至传到P3代兔脂肪间充质干细胞。P3代兔脂肪间充质干细胞形态学上为全贴壁生长，形态呈大小相对均匀的长梭形、漩涡或鱼族群状均匀排列，流式细胞仪检查结果进一步证明该细胞为兔脂肪间充质干细胞。

1.4.7 复合支架浸提液的制备将复合支架用体积分数75%乙醇浸泡24 h，取出后用高压蒸汽灭菌超纯水清洗5次，再放入超净工作台，紫外线照射1 h消毒。然后根据参考文献[9]提供的国家疗器械生物学评价(GB/T16886.11- 1997)方法制备支架浸提液，即按照支架表面积/浸提介质= 3 cm²/1 mL标准加入DME/F-12完全培养基(体积分数10%胎牛血清、1%双抗)，置于体积分数5%CO₂、37 ℃恒温细胞培养箱中浸提72 h，将所得浸提液用0.22 μm的细菌滤过器过滤，4 ℃保存备用。

采用同样方法以生理盐水为浸提介质制备支架浸提液，用于溶血实验及体内急性毒性实验。

1.4.8 CCK-8法检测脂肪间充质干细胞增殖率取培养的P3代脂肪间充质干细胞，用0.25%胰酶消化，800 r/min离心5 min，弃上清，2 mL培养基重悬，制备成细胞悬液。细胞计数板计数后。将其按2×10⁸ L^-1的细胞浓度接种到96孔板中，每孔100 μL，放入细胞培养箱中贴壁生长24 h后，按实验分组要求分别更换为下述不同培养液：正常培养基(对照组)、3D打印微小颗粒骨/PLGA复合浸提液(实验组)，并设置空白对照组(仅有培养液，无细胞)调零，同样每孔量100 μL，共3组，每组设6个复孔，隔日换液。分别于培养1，3，5，7 d后取出96孔板，于超净台内按每孔10 μL加入CCK-8溶液，在放回细胞培养箱内避光孵育2 h，取出标本用酶标仪测量各组在450 nm的吸光度A值。根据A值计算细胞相对增殖率，按照参考文献[9]评价支架细胞毒性。

细胞相对增殖率=(实验组A值-空白对照组A值)/(对照组A值-空白对照组A值)

1.4.9 溶血实验取新西兰大白兔1只，按4 mL/kg水合氯醛腹腔麻醉后，20 mL注射器进行心脏采血，将所采血液置于抗凝管中，加入5 mL生理盐水制备成稀释后兔抗凝血。将生理盐水、蒸馏水、复合支架浸提液于37 ℃恒温水浴箱中预热半小时。取生理盐水(阴性对照组)、蒸馏水(阳性对照组)、复合支架浸提液(实验组)各5 mL于离心管内，各自加入稀释后兔抗凝血0.2 mL，充分摇匀后，置于37 ℃水浴箱继续温育50 min后离心，取上清液，于酶标仪545 nm波长测量其A值，每组设置7个复孔，计算其溶血率。参照ISO10993-4:2002标准进行溶血率评价：溶血率≤5%，表明材料符合医疗生物材料溶血要求，溶血率>5%则不符合要求。

溶血率=(实验组A值-阴性对照组A值)/(阳性对照组A值-阴性对照组A值)×100%

1.4.10 急性毒性实验将复合支架浸提液预热至37 ℃。将8只新西兰大白兔随机分成2组，实验组4只按50 mL/kg腹腔注射常温复合支架浸提液，对照组4只腹腔注射等量生理盐水，注射后72 h观察内兔的一般状况(如饮食、睡眠、活动、呼吸、尿便)，记录有无中毒表现、死亡的发生。1周时处死上述实验兔，取其心、肝、肾组织行苏木精-伊红病理染色，观察主要器官组织有无急性中毒改变。

1.5 主要观察指标 3D打印复合支架的表观及内部结构、孔隙率、吸水率、水接触角及体外降解率；3D打印复合支架的细胞毒性、溶血率、急性毒性实验结果。

1.6 统计学方法采用SPSS 22统计软件进行分析，计量资料采用x(_)±s表示，两组间比较采用独立样本t 检验。检验水准为α=0.05，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

随着科学技术的发展，极大地推动了组织工程学在医学领域的研究运用，它是将生命科学和工程学相结合运用的一门新兴科学，骨组织工程是其中的重要组成部分，利用骨组织工程技术有望构建出与人体骨相似的骨组织^[10-11]。而种子细胞、支架材料、生长因子是构成骨组织工程的3大要素，理想的材料要求具有较好的骨传导、骨诱导性，生物可降解性，可吸收性，一定的机械性能和塑型能力，良好的生物相容性及一定的成骨能力^[12-14]。传统制备支架的方法包括溶剂浇铸、冷冻干燥、气体发泡、颗粒/盐析出等，虽取得了一定效果，但无法满足现代骨组织工程对支架设计的要求，且传统支架材料大多数为金属材料^[15-18]。目前应用于骨组织工程领域的3D打印技术主要有熔融沉积、光固化立体印刷、选择性激光烧结、三维喷印等，因熔炉沉积型3D打印技术多以低熔点生物材料实现3D固化成型打印，技术相对成熟，打印操作相对简单可行，成本相对低廉，打印材料种类丰富，打印速度快，适用于医疗科研技术行业而被广泛运用^[19-21]。基于上述优点，此次实验采用熔炉沉积型3D打印技术制备支架材料，但在实验中，该3D打印技术对生物打印材料的黏性、熔融温度、冷却收缩率都有较高要求，需高温成型，打印精度存在一定误差，打印空间狭小。同时，实验中使用熔炉沉积型3D打印机制备支架时，需要先将材料制备成0.75 cm的线材后再用于支架打印，即2次高温成型，可能会对支架的组织成分造成一定影响。

熔炉沉积型3D打印技术在生物打印材料选择方面，骨组织工程研究中运用较多的材料有丙烯酸-丁二烯-苯乙烯三元共聚物、聚乳酸和聚己内酯^[22]。如Cao等^[23]以聚己内酯为原料，通过用熔炉沉积型3D打印技术制备生物组织支架，发现纯聚己内酯原料的生物活性不足，制备支架材料受限制。彭齐峰^[24]通过熔炉沉积型打印技术成功制备了5%和10%两种不同含量的微小颗粒骨/聚乳酸支架材料，打印过程中发现随着骨粉含量的增加，成型难度加大；对2种支架进行相关性能研究发现，支架体外降解6个月后质量剩余93.8%，材料短期内降解效果不理想。目前在3D打印领域运用PLGA的研究已逐渐增多，PLGA按乳酸∶羟基乙酸2种单体比例不同，其性能也随之变化，比例为1∶1聚合而成的PLGA具有最大限度无规结构，水分子渗透快，因此降解速率较其他比例快。此外，PLGA的降解产物为乳酸和羟基乙酸，自身及降解产物均无生物毒性，且易于成膜、成囊。在美国，PLGA已通过FDA认证，被作为药用辅料正式收入美国药典^[25-27]。同种异体骨除具有骨传导作用外，还兼有一定的骨诱导能力。虽然同种异体骨存在一定的免疫排斥等不良反应，植入后可能造成手术失败，但同种异体骨来源广泛，且通过脱脂、脱钙、脱蛋白、冻干处理后能够最大程度降低免疫原性，仍是一种理想的骨移植材料^[28]。龙志成等^[29]运用脂肪干细胞复合羟基磷灰石/β-磷酸三钙与同种异体骨修复兔脊柱骨缺损的比较研究发现，2种材料均具有良好的生物相容性。瞿卫等^[30]运用小颗粒同种异体骨微创植骨治疗208例四肢骨缺损，证明小颗粒同种异体骨有明显促进骨折愈合的作用，临床实用性较好。因此在该实验中，高分子材料选用降解性能较好的PLGA，但PLGA熔点低、脆性大，熔化后黏性明显增强，当线材通过熔炉沉积型3D打印机喷头时，由于打印温度较高，线材熔化过快，容易堵塞打印机喷头和线材折断，导致打印失败。此外，PLGA自身的骨传导性较弱及机械强度不够，其自身降解产物偏酸性，可能引起周围炎症反应^[31]。为对PLGA的上述缺陷进行改性，实验中加入体积分数为20%的兔同种异体骨粉，并结合熔炉沉积型3D打印技术制备出所需的复合支架。

对于复合支架的物理性能，首先实现了支架孔隙的个性化设计打印，通过扫描电镜检测能观察到相对均匀的孔隙，且有孔隙间相互连通的微观结构，孔隙率测定结果较好。而支架材料良好的孔隙率和孔隙间互通性，可为细胞浸润和骨组织细胞生长提供适当的空间环境^[32]。此外，材料表面的亲水性和疏水性被认为是决定组织细胞黏附生长的重要前提因素，通常情况下当水接触角<90°被认为材料具有良好亲水性，水接触角越小亲水性越好，越能促进组织细胞的黏附生长^[33-35]。该复合支架吸水率良好，水接触角<90°，表明该材料具有良好的亲水性能，有望为组织细胞的黏附、增殖提供良好的亲水性条件。最后，通过分析该支架体外降解情况可知，在体外4周内降解较慢，4周后降解加速，11周左右全部降解，从该支架材料降解时间曲线看，前4周内该支架材料仍能起到一定的支撑作用，从整个体外降解周期、吸收速度看，该支架的降解吸收时长与骨质生长周期相近，有望实现复合支架降解和骨缺损修复治疗同步化。因此，具有上述物理特性的生物支架材料，有望弥补传统支架材料所带来的不足，如金属钛支架无体内外降解性能，陶瓷支架由于较差的机械力学性能不能用于大段骨缺损的修复治疗，无法实现临床骨缺损治疗的高度个性化设计^[36-38]。但复合支架打印相对粗糙，孔径大小与原始设计仍存在一定差异，亲水性能仍需改善，高温条件下无法实现生物打印，打印后多需进行支架生物涂层处理是其不足之处，对支架的机械强度和体内外成骨能力仍需进一步实验观察。

然而任何组织工程支架在进行动物实验及临床应用前，都必须进行生物相容性检测，包括细胞相容性和组织相容性，以确保材料的生物安全性，目前可采用体外实验和动物体内实验检测其生物相容性^[39-40]。在骨组织工程中，体外生物相容性实验经常采用的种子细胞有脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、软骨细胞及骨细胞，因脂肪间充质干细胞具有多向分化潜能、来源广泛、取材方便、易于培养等优点，是目前骨组织工程领域的重要种子细胞^[41-42]。实验首先通过提取分离、培养、传代兔脂肪间充质干细胞，采用支架浸提液对脂肪间充质干细胞进行培养，利用CCK-8毒性实验检测复合支架的体外细胞生物相容性，结果证明支架浸提液的细胞毒性为1级，且该支架浸提液的溶血实验阴性，均表明该支架材料无明显细胞毒性。另外，在体内急性毒性实验中，所有实验兔无任何急性中毒反应表现，两组实验兔心、肝、肾标本的病理苏木精-伊红染色均无异常毒性表现，进一步表明该材料在动物体内具有良好生物相容性。因此，从上述生物相容性实验中可知，该复合支架材料相对安全无毒，体内外生物相容性良好，将为进一步制备支架+种子细胞+细胞因子复合体支架和动物体内相关实验研究奠定了良好实验基础。

综上所述，利用兔同种异体微小颗粒骨与无毒、可降解吸收的PLGA按1∶5混合后，通过熔炉沉积型3D打印技术制备的复合支架，具有良好孔隙率、吸水率和亲水性能，体外降解完全，且无明显细胞毒性和体内毒性，具有良好的物理性能和生物相容性，是一种相对安全无毒的可降解性生物支架材料。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程