聚集蛋白代谢通路基因多态性与腰椎间盘突出严重程度的相关性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1457

摘要/Abstract

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文题释义：
基质金属蛋白酶3：基质金属蛋白酶家族蛋白参与细胞外基质在正常生理过程中的破坏，如胚胎发育、生殖、组织重塑，以及在疾病过程中，如关节炎和转移。大多数基质金属蛋白酶是作为非活性的前蛋白分泌的，在细胞外蛋白酶裂解时被激活。该基因编码一种酶，可降解纤维连接蛋白、层粘连蛋白、胶原蛋白Ⅲ、Ⅳ、Ⅸ和Ⅹ，以及软骨蛋白聚糖。这种酶被认为参与了伤口修复、动脉粥样硬化的进展和肿瘤的发生。
蛋白聚糖：是蛋白聚糖家族的成员之一。编码的蛋白是软骨组织中细胞外基质的组成部分，作用是能承受软骨的压缩。该基因的突变可能与骨骼发育不良和脊髓变性有关。目前在该基因中观察到了编码不同蛋白质亚型的多个选择性剪接转录变体。

摘要
背景：椎间盘突出是一种复杂的脊柱疾病，与椎间盘退变密切相关，而聚集蛋白聚糖的代谢途径的候选基因可能与腰椎间盘突出的严重程度相关。
目的：评估单核苷酸变异和慢性机械性腰痛患者腰椎间盘突出严重程度的蛋白聚糖的代谢途径的基因的关联。
方法：对60例慢性机械性腰痛患者进行了分类描述研究。T2加权正中矢状位腰椎MRI扫描评估椎间盘突出和椎间盘退变的严重程度。对凝集素代谢途径的2个候选基因(蛋白聚糖和基质金属蛋白酶3)的20个外显子单核苷酸变异进行了基因分型。对年龄、性别、体质量指数和椎间盘退变程度进行多元线性回归分析。试验于2015-03-01经定州市人民医院伦理委员会批准(批准号2015002)。
结果与结论：蛋白聚糖的rs2272023、rs938609、rs2882676、rs698621、rs3825994、rs1042630和rs3817428突变体及其单倍型与腰椎间盘突出的严重程度有关。若要确定这些重要的单核苷酸变异在椎间盘突出症的发病机制中的作用，有必要进行功能遗传方面的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-4567-2930(杨金丰)

关键词: 椎间盘突出, 聚集蛋白, 基因多态性, 遗传, 基质金属蛋白酶, 慢性机械性腰痛, 蛋白聚糖, 基因分型

Abstract:

BACKGROUND: Protrusion of intervertebral disc is a complex spinal disease, which is closely related to the degeneration of intervertebral disc. Candidate genes of aggregation proteoglycan metabolic pathway may be related to the severity of protrusion of lumbar intervertebral disc.
OBJECTIVE: To assess the association between single nucleotide variants and proteoglycan metabolic pathways in the severity of lumbar disc herniation in patients with chronic mechanical low back pain.
METHODS: Sixty patients were classified and described. T2-weighted median sagittal lumbar MRI scans were used to assess the severity of disc herniation and degeneration. Single nucleotide variants genotyping of 20 exons of two candidate genes (proteoglycan, matrix metalloproteinase 3) of lectin metabolic pathway was performed. Age, sex, body mass index and the degree of intervertebral disc degeneration were analyzed by multiple linear regression. The trial was approved by the Ethics Committee of People’s Hospital of Dingzhou on March 1, 2015 (approval No. 2015002).
RESULTS AND CONCLUSION: The mutants and haplotypes of rs2272023, rs938609, rs2882676, rs698621, rs3825994, rs1042630 and rs3817428 of proteoglycan are related to the severity of lumbar disc herniation. The single nucleotide variants and its haplotype of proteoglycan are related to the severity of lumbar disc herniation. To determine the role of these important single nucleotide variants in the pathogenesis of intervertebral disc herniation, functional genetic studies are necessary.

Key words: protrusion of intervertebral disc, aggregate protein, gene polymorphism, heredity, matrix metalloproteinase, chronic mechanical low back pain, proteoglycan, genotyping

中图分类号:

杨金丰, 马三辉. 聚集蛋白代谢通路基因多态性与腰椎间盘突出严重程度的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2019, 23(31): 4939-4944.

Yang Jinfeng, Ma Sanhui. Association between polymorphism of aggregate protein metabolic pathway gene and severity of lumbar disc herniation [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2019, 23(31): 4939-4944.

图/表（结果） 4

2.1 患者临床基线特征 60例患者参加了腰椎MRI扫描和基因分型，患者平均年龄(52.53±7.34)岁，其中70%患者是女性，63%患者超重和肥胖，92%(55例)患者椎间盘突出，42%(25例)患者椎间盘退化，椎间盘突出的平均严重程度为(2.8±2.0)级，见表1。

分析候选基因的单核苷酸变异、等位基因频率和Hardy-Weinberg遗传平衡差异，结果显示次要等位基因频率为0.05-0.50，所有变异均符合Hardy-Weinberg遗传平衡，见表2。

2.2 ACNS单核苷酸变异与腰椎间盘突出的相关性结果显示7例ACAN单核苷酸变异与椎间盘突出症的严重程度相关。椎间盘突出的严重程度随着rs2272023突变体、rs2882676突变体、rs1042630突变体A等位基因频率的增加而增加。此外，RS938609突变体的A等位基因、RS3825994突变体的G等位基因与椎间盘突出的严重程度相关。单核苷酸变异的RS938609突变体处于连锁不平衡(R₂=20.93，D’=0.98)。ACAN的rs3817428突变体不具有小等位基因的纯合基因型，G等位基因的存在与椎间盘突出严重程度的降低有关。其他候选基因的单核苷酸变异与椎间盘突出症严重程度之间没有显著相关性，见表3。

2.3 ACAN单倍型与腰椎间盘突出严重程度的关系在7个单核苷酸变异中，rs938609和rs2882676形成3个单倍型，rs3825994和rs1042630也形成3个单倍型。在单倍型分析中，rs938609和rs2882676位点的T-A单倍型和rs3825994和rs1042630位点的T-A单倍型增加了椎间盘突出症的严重程度。相比之下，A-C单倍型rs938609和rs2882676位点以及G-G单倍型rs3825994和rs1042630位点在调整混杂因素(年龄、性别、体质量指数和腰椎间盘退变的严重程度)后降低了椎间盘突出的严重程度。多变量线性回归分析的单倍型频率和结果汇总见表4。

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引言

腰椎间盘突出是一种复杂的多因素脊柱疾病，而腰椎间盘退变与椎间盘突出密切相关^[1]。传统观点认为，腰椎间盘退变和突出症主要与年龄、性别、体质量指数、吸烟、体力活动和脊柱负荷有关^[1]。但最近有研究发现聚集蛋白聚糖的代谢途径候选基因的单核苷酸变异与腰椎间盘退变之间有显著的相关性^[2]。因此，探讨椎间盘突出各候选基因与椎间盘突出的相关性具有重要的意义。

聚集蛋白是椎间盘中的主要蛋白多糖，提供其渗透特性，也能帮助椎间盘抵抗沿脊柱传递的机械压缩载荷^[3]。随着年龄的增长，椎间盘由于蛋白聚糖的丢失而脱水，并且退化过程由于重复的损伤而进一步增强，这将椎间盘转变成退行性状态，可能导致椎间盘突出的发生^[4]。

聚集体代谢途径中候选基因的异常遗传变异可改变聚集体分子的结构和功能特性。虽然有多项研究已经证实蛋白聚糖(Aggrecan，ACAN)可变数目串联重复多态性与腰椎间盘退变和症状性腰椎间盘突出有关^[5]，但是缺乏研究探讨ACAN的单核苷酸变异与腰椎间盘突出严重程度之间的关系。

在腰椎间盘退变和突出的过程中，细胞因子由间盘细胞和一些炎性细胞产生并分泌到胞外的调节细胞活性功能的高活性多功能多肽，具有多种生物学功能，其中基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP3)是一种主要的炎症介质，它可以降解蛋白多糖聚合体及椎间盘内多种基质成分，减少髓核的脱水作用^[6]。

早期发现遗传易感个体可通过改善生活方式等预防椎间盘突出的发生。鉴于单核苷酸变异/单倍型是未来基因治疗的可能靶点^[3，7-8]。作者扩展了研究范围，以研究聚集体代谢途径候选基因与腰椎间盘突出严重程度的关系。

此次试验拟探讨慢性机械性腰痛患者聚集素代谢途径候选基因的单核苷酸变异与椎间盘突出严重程度的关系。此外还将评估候选基因的显著单核苷酸变异及其单倍型与腰椎间盘突出严重程度的相关性。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 对象和方法 Subjects and methods

1.1 设计基因多态性关联分析。

1.2 时间及地点于2015年3月至2018年3月于河北省定州市人民医院骨科实验室完成。

1.3 对象选取2015年3月至2018年3月在河北省定州市人民医院骨科住院的慢性机械性腰痛患者。

纳入标准：①结合临床症状、物理检查和影像学检查均已确定为机械性原因引起的腰痛患者，其中也包括中局部肋下有疼痛、肌紧张或僵硬的、臀下皱襞的^[9-10]；②运动至少3个月以上的时间后期恶化的；③年龄20-70岁；④获得书面知情同意。

排除标准：①存在由炎症引起的全身性感染者；②由内脏病变影响脊柱健康者；③有骨代谢疾病者；④存在脊柱骨折病史者；⑤患有脊柱肿瘤者。

最终纳入60例慢性机械性腰痛患者。根据椎间盘相关的严重程度的退行性改变状况，接受MRI腰椎扫描及基因分型。所有志愿者都签署了参与研究的书面知情同意书。试验于2015-03-01经定州市人民医院伦理委员会批准(批准号2015002)。

1.4 方法

1.4.1 临床评价采用问卷调查法记录年龄、性别，临床检查法记录体质量指数。体质量指数=体质量(kg)/身高²(m)。患者身高(cm)和体质量(kg)分别用轻便衣物和不穿鞋评定至最接近0.1 cm和0.1 kg，计算体质量指数(kg/m²)。国际亚洲区间值被用于分类体质量指数(正常18.5-23.9 kg/m²、超重 24-27.9 kg/m²和肥胖 ≥28 kg/m²)^[11]。

1.4.2 X射线评估患者侧卧，进行腰椎侧位X射线检查。在腰椎侧位X射线片中，评估椎间盘间隙(L₁/L₂到L₅/S₁)是否狭窄和前部骨赘，并根据评分系统计算总的腰椎间盘退变(0±2级)^[12]。

1.4.3 核磁共振成像评估选择在腰椎侧位X射线检查中2级以上腰椎间盘退变的患者进行T2加权正中矢状位腰椎MRI扫描。选择年龄和性别匹配的0级和1级腰椎间盘退变患者进行腰椎MRI扫描。使用GE 1.5T MRI扫描仪(美国GE公司)在仰卧位进行腰椎T2加权矢状位MRI扫描，评估腰椎间盘退变和椎间盘突出症的严重程度。

1.4.4 腰椎间盘退变严重程度评估使用改进Pfirrmann分级系统对T2加权中矢状位MRI图像进行腰椎间盘退变的严重程度分级^[13]，并且每个腰椎水平从1级分级到5级。2级和3级被定义为轻度腰椎间盘退变，而4级和5级被定义为严重腰椎间盘退变。将5种腰椎间盘退变程度进行积分，计算腰椎间盘退变的严重程度。

1.4.5 腰椎间盘突出的严重程度标准椎间盘形态分为正常、退化、突出、脱出，正常的椎间盘指完全发育成熟的没有疾病、创伤、老化的椎间盘，无突出的椎间盘。椎间盘突出是指超出椎间盘间隙的局限性椎间盘物质的移位，移位的椎间盘组织可以是髓核、软骨、破碎的骨骺骨、纤维环或任何上述组织的混合物，椎间盘间隙在头尾方向上以椎间盘终板为界，外周以椎体骺环的最外侧边界为界，不包括骨赘，局限是指不到椎间盘圆周的50%(180°)。腰椎间盘脱出：是突出的髓核掉入椎管引起椎管狭窄，压迫神经，使腰部及腿部有麻痛感，严重者尿便失禁，肌肉萎缩，甚至瘫痪，这是腰椎间盘病变中最重的一种类型。以此标准来计算腰椎间盘突出程度^[14]。

1.4.6 单核苷酸变异选择、DNA提取及基因分型候选基因(ACAN和MMP3)在聚集蛋白代谢途径的外显子区域中的共同单核苷酸变异。选择20个单核苷酸变异在聚集蛋白代谢途径候选基因的外显子区域进行基因分型。从200 mL上臂静脉血中提取DNA，用荧光计和定量荧光双链DNA系统(Promega)对提取的DNA进行定量，并进行基因分型。虽然ACAN存在可变数目串联重复多态性，该多态性与椎间盘突出症严重程度有关^[2]，但此次试验仅关注外显子单核苷酸变异。

1.5 主要观察指标椎间盘突出的严重程度与ACAN和MMP3单核苷酸变异情况。

1.6 统计学分析采用描述性统计方法对样本特征进行总结。用PLINK 1.9软件(http://www.cog-genomics. org/plink/1.9/dev)进行多元线性回归分析，对单核苷酸变异进行数量性状关联。Hardy-Weinberg遗传平衡分析：单位点组Hardy-Weinberg检验，χ²=∑(期望值-观察值)²/期望值；而对于遗传平衡双位点组合检验为每组双位点表型组和Hardy-Weinberg期望值χ²检验。采用多元线性回归模型进行定量分析。候选基因的显著单核苷酸变异单倍型与椎间盘突出症的严重程度相关。应用SPSS V19软件(美国IBM公司)进行统计学分析。定量资料采用 x(_)±s表示，定性资料采用百分率表示，组间比较采用χ²检验。所有统计学检验均为双向，且P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

此次试验评估了慢性机械性下腰痛患者聚集体代谢途径候选基因单核苷酸变异与腰椎间盘突出严重程度的关系。ACAN的rs2272023(C)、rs2882676(A)、rs698621(G)、rs938609(A)、rs3825994(G)、rs1042630(A)和rs3817428 (G)突变体的小等位基因与腰椎间盘突出的严重程度相关。rs938609和rs2882676位点的单倍型以及ACAN的rs3825994和rs1042630位点的单倍型与腰椎间盘突出的严重程度相关。

在所选择的20个候选基因单核苷酸变异中，只有7个ACAN单核苷酸变异与椎间盘突出症严重程度相关，包括4个非同义突变体(rs938609、rs2882676、rs1042630和rs3817428)和3个同义突变体(rs2272023、rs3825994和rs3817428)。非同义突变体改变了相应蛋白质的氨基酸序列。这种改变的氨基酸序列可能影响各自蛋白质的功能^[15-16]。相比之下，同义突变体不会改变相应蛋白质的氨基酸序列，但是通过影响蛋白质表达、构象和功能，它可以引起引起疾病的长非编码RNA、小RNA和引物的改变。此外，任何非同义或同义突变体可作为同一基因或附近基因中功能单核苷酸变异的标记。研究显示，与该疾病显著相关的可变数目串联重复多态性很可能因此被发现，因为它们与致病性单核苷酸变异处于连锁不平衡^[17-18]。因此试验的重点是评估与椎间盘突出症的严重程度相关的单核苷酸变异。

也有研究选择了另外一些基因来研究其多态性与椎间盘退行疾病的关系，如IL1A，IL1B，IL6，ADAMTS4，ADAMTS5，TIMP1，TIMP2和 TIMP3。多项研究报道了IL6，IL10，MMP1和MMP3的单核苷酸变异与椎间盘突出的显著相关性^[19-20]。这些变异中有些是内含子变异，有些变异在种群中不是多态性的。在作者既往研究中，单核苷酸变异的IL1A(炎症基因)ADAMTS4和ADAMTS5(分解代谢的基因）被发现与椎间盘退化的严重性^[2]，但是这些单核苷酸变异没有与这些真实的椎间盘突出。因此，这2项研究的结果表明，炎症和代谢途径中候选基因的单核苷酸变异是椎间盘退变的原因，而ACAN(结构基因)的单核苷酸变异是椎间盘突出的原因。

目前已有少数研究探讨ACAN的单核苷酸变异与椎间盘突出严重程度的关系^[21]。有统计发现ACAN的rs1042631突变体的每个T等位基因的存在增加了人群中椎间盘突出的概率，但是这一变型与椎间盘突出症的严重程度无关^[22]。在此次试验中，ACAN的rs938609突变体处于强连锁不平衡，每个附加的小等位基因逐渐降低椎间盘突出症的严重程度。

ACAN的rs1042630(A)和rs2882676(A)突变体的每个附加的次要等位基因的存在与椎间盘突出症的严重程度的进行性增加相关，而ACAN的rs3817428突变体的附加的G等位基因的存在降低了椎间盘突出症的严重程度。

位于ACAN第15外显子的RS3817428突变体导致天冬氨酸在氨基酸序列的位置2373处发生谷氨酸取代。这是在ACAN高度保守的区域，但其氨基酸取代是高度保守的替代。

单倍型分析结果进一步证实了ACAN的单核苷酸变异与腰椎间盘突出严重程度的相关性。在单倍型分析中，发现T-A(rs938609-rs2882676)和T-A(rs3825994 rs1042630)单倍型增加了椎间盘突出症的严重程度，而A-C (rs938609-rs2882676)和G-G(rs3825994-rs1042630)单倍型降低了椎间盘突出症的严重程度。这表明椎间盘突出的严重程度受单核苷酸变异和单倍型差异的影响。虽然遗传因素在椎间盘退变过程中起着重要作用，但退变性椎间盘疾病的病因机制仍然复杂。年龄、遗传、职业、损伤等均与椎间盘退变有关^[23]，是多阶段的过程^[24]，聚集蛋白基因多态性可能只是其中的一个方面。环境因素可能在不同的阶段发挥不同的作用^{[7，18，25-26]}，遗传因素可能不是一个特定的基因，而是多种基因共同作用。目前已有相关研究存在样本量小的缺点，结合民族和地域差异，基因多态性可以表现出较大的差异，进而得出不同的结论。还没有纠正已经评估的多个突变体和其他相应基因中的其他可能突变体的遗传关联分析。利用全基因组测序和功能遗传学研究对大样本数进行遗传关联分析以确定显著的单核苷酸变异的确切效果是很重要的。

研究的局限性：这项研究的结果并不具有普遍性，因为它是在特定的一组慢性机械性下腰痛患者中进行的。样本数小是另一个局限，但是使用PLINK软件工具的置换函数并校正由于小样本量导致的误差。可能还有其他混淆因素，但未能纠正。

结论：ACAN的单核苷酸变异及其单倍型与腰椎间盘突出的严重程度有关，这将为腰椎间盘突出新的治疗方案提供了遗传标记物的基本见解。

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