Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞修复骨性关节炎的关节损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0996

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
慢病毒载体：慢病毒载体是调控生物基因表达与功能最常用的载体系统，能够将目的基因完整的整合至靶细胞，实现长期稳定的表达，具有转染效率高、免疫反应小等优点，该技术目前已成为研究基因功能和实现基因治疗的重要手段。
Runx2：Runx2基因位于人类常染色体的6p21，长约220 kb，包括8个外显子，并具有和其他家族成员相似的Runt结构域，是骨发育过程中调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化和成熟最关键的转录因子，在骨修复与重建中发挥重要作用。

摘要
背景：研究发现骨髓间充质干细胞作为种子细胞可分化为成软骨细胞和成骨细胞，Runx2能够诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细分化、成熟，从而促进骨愈合。
目的：探讨Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞在骨性关节炎关节损伤修复中的作用。
方法：①分离培养C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞，用Lenti-Runx2-EGFP慢病毒(Runx2组)转染细胞，同时转染不含Runx2基因的慢病毒(阴性对照组)，并设置未用慢病毒转染的空白对照组；转染48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达，计算转染效率，并用嘌呤霉素筛选稳定转染的细胞株；②将C57BL/6小鼠膝关节前交叉韧带切断建立骨性关节炎模型，并随机分为生理盐水组、单纯骨髓间充质干细胞组、Runx2转染骨髓间充质干细胞组；分别于小鼠膝关节腔内注射0.1 mL生理盐水、0.1 mL含1×10⁷个单纯骨髓间充质干细胞的生理盐水、0.1 mL含1×10⁷个Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞的生理盐水。
结果与结论：①骨髓间充质干细胞表面标志抗原CD90、CD105高表达，慢病毒转染效率(88.57±3.07)%，经4 mg/L嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞；②Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨完整，无明显退化，关节面平整；其他2组软骨退变，关节面不平；③Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨细胞多，软骨层厚；其他2组软骨细胞减少，软骨层变薄，且Runx2转染骨髓间充质干细胞组Mankin’s评分低于其他2组；④Runx2转染骨髓间充质干细胞组Ⅱ型胶原蛋白阳性率大于其他2组，Ⅹ型胶原蛋白阳性率小于其他2组；⑤Runx2转染骨髓间充质干细胞组Runx2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白蛋白及mRNA表达高于其他2组；⑥结果说明，Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞能够促进骨性关节炎关节损伤修复，从而为骨性关节炎的临床治疗提供新的方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-1435-1269(矢庆明)

关键词: Runx2, 慢病毒, 骨髓间充质干细胞, 骨形成蛋白2, 碱性磷酸酶, 骨钙素, 骨桥蛋白, 骨性关节炎, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow mesenchymal stem cells as seed cells can differentiate into chondrocytes and osteoblasts. Runx2 can induce bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate and mature into chondrocytes and osteoblasts, thus promoting bone healing.
OBJECTIVE: To investigate the effect of lentiviral-mediated Runx2 transferred into bone marrow mesenchymal stem cells in the repair of joint injury due to osteoarthritis.
METHODS: (1) Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured from C57BL/6 mice. Lenti-Runx2-EGFP lentivirus (Runx2 group) was transfected into bone marrow mesenchymal stem cells, lentivirus without Runx2 gene (control group) was transfected, and a blank control group was setup. After 48 hours of transfection, the expression of green fluorescent protein was observed under the fluorescence microscope, and the transfection efficiency was calculated. The stably transfected cell line was screened by purinomycin. (2) A model of osteoarthritis was established in C57BL/6 mice by cutting off the anterior cruciate ligament of the knee joint. All of the model mice were randomly divided into normal saline group, bone mesenchymal stem cell group and Runx2-transfected bone mesenchymal stem cell group. 0.1 mL of normal saline, 0.1 mL of normal saline containing non-transfected bone marrow mesenchymal cells (1×10⁷), or 0.1 mL of normal saline containing Runx2-transfected bone marrow mesenchymal cells (1×10⁷) was injected into the knee joint cavity of mice in the corresponding group, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) CD90 and CD105 were highly expressed in bone marrow mesenchymal stem cells. The transfection efficiency of Lenti-Runx2-EGFP lentivirus was (88.57±3.07)%, and the stably transfected cell line was screened by puromycin (4 mg/L). (2) The knee articular cartilage of mice was intact with smooth knee articular surface in the Runx2-transfected bone mesenchymal stem cell group, while knee articular cartilage degeneration and uneven knee articular surfaces were observed in the other two groups. (3) The chondrocytes decreased and the cartilaginous layer thinned in bone mesenchymal stem cell group, while a lot of cracks on the surface of the cartilage in the saline group. Runx2-transfected bone mesenchymal stem cell group had many chondrocytes and thickened cartilaginous layer, and the Mankin’s score was significantly lower than the other two groups. (4) The positive rate of type II collagen in Runx2-transfected bone mesenchymal stem cell group was significantly higher than that in the other two groups, while the positive rate of type X collagen was lower than the other two groups. (5) The mRNA and protein expressions of Runx2, bone morphogenetic protein-2, alkaline phosphatase, osteocalcin and osteopontin in Runx2-transfected bone mesenchymal stem cell group were significantly higher than those in the other two groups. To conclude, Runx2-transfected bone marrow mesenchymal stem cells can promote the repair of damaged cartilage, thus providing a new direction for the clinical treatment of osteoarthritis.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Osteoarthritis, Lentivirus Infections, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

段志斌，仇志强，彭鲲，徐泽敏，成科，陈翔，矢庆明. Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞修复骨性关节炎的关节损伤[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(29): 4607-4613.

Duan Zhi-bin, Qiu Zhi-qiang, Peng Kun, Xu Ze-min, Cheng Ke, Chen Xiang, Shi Qing-ming. Lentiviral-mediated Runx2 transfection of bone marrow mesenchymal stem cells in the repair of joint injury due to osteoarthritis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(29): 4607-4613.

图/表（结果） 2

2.1 骨髓间充质干细胞形态观察和鉴定 第3代骨髓间充质干细胞，形态基本一致，呈长梭形，“鱼群”样朝向同一样方向排列，见图1。流式细胞仪检测显示，骨髓间充质干细胞CD90阳性率99.6%，CD105阳性率99.4%，见图2。

2.2 Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞及稳定转染细胞株筛选 转染48h后，Runx2组和阴性对照组转染效率分别为(88.57±3.07)%和(89.43±2.09)%，并经最佳浓度的嘌呤霉素(4 mg/L)筛选得到了稳定转染细胞株，见图3。

2.3 实验动物数量分析 各组10只小鼠在实验期间均无脱失，均结果结果分析。

2.4 膝关节X射线结果 植入2周后，生理盐水组小鼠膝关节软骨退变明显，有缺损迹象，关节面不平整(图4A)；单纯骨髓间充质干细胞组软骨退变程度较生理盐水组轻微，尚未发现缺损迹象，关节面较平整(图4B)；Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨完整，未见明显退化，关节面平整(图4C)。

2.5 膝关节软骨组织形态及Mankin’s评分 植入2周后，生理盐水组软骨表层存在大量裂隙(图5A)；单纯骨髓间充质干细胞组软骨细胞稍减少，软骨层稍变薄(图5B)；Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨细胞多，软骨层厚(图5C)。

Runx2转染骨髓间充质干细胞组Mankin's评分为(2.47±0.56)分，显著低于单纯骨髓间充质干细胞组和生理盐水组[分别为(4.17±0.48)，(6.82±0.63)分]，差异有显著性意义(F=153.231，t=6.788、17.369，P < 0.001)。

2.6 膝关节软骨组织Ⅱ型及Ⅹ型胶原蛋白表达 植入2周后，免疫组化染色结果显示，Runx2转染骨髓间充质干细胞组Ⅱ型胶原蛋白阳性率显著大于单纯骨髓间充质干细胞组和生理盐水组(t=14.347，23.484，均P < 0.001)；而Ⅹ型胶原蛋白阳性率显著小于单纯骨髓间充质干细胞组和生理盐水组(t=10.823，22.461，均P < 0.001)，见表1，图6。

2.7 膝关节滑膜组织Runx2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白mRNA表达水平 植入2周后，反转录PCR检测结果显示，Runx2转染骨髓间充质干细胞组Runx2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白mRNA表达显著高于单纯骨髓间充质干细胞组和生理盐水组(P < 0.001)，见表2。

2.8 膝关节滑膜组织Runx2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白表达水平 植入2周后，蛋白印迹法检测结果显示，Runx2转染骨髓间充质干细胞组Runx2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白表达显著高于单纯骨髓间充质干细胞组和生理盐水组(P < 0.001)，见表3，图7。

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引言

材料方法

1.1 设计 细胞学体外实验和动物体内实验观察。

1.2 时间及地点 于2016年3月至2017年10月在南昌大学第二附属医院实验室完成。

1.3 材料

实验动物：SPF级雄性C57BL/6小鼠30只，鼠龄3周，体质量约10 g，购自上海斯莱克实验动物中心，动物许可证号：SCXK(沪)2012-0002，用于骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定。实验经南昌大学第二附属医院伦理委员会批准，批准号为20160123。

实验用主要试剂和仪器：Runx2过表达慢病毒载体购自美国System Biosciences公司；DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液购自美国Gibco公司；TRIzol总RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司；反转录试剂盒(美国ABI Applied Biosystems公司；RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；兔抗鼠一抗(抗Runx2、抗骨形成蛋白2、抗碱性磷酸酶、抗骨钙素、抗骨桥蛋白)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，二氨基联苯胺显色试剂盒，均购自美国Santa Cruz；小鼠Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白免疫组化试剂盒购自美国R＆D公司；超净工作台、恒温CO₂培养箱、酶标仪购自美国Thermo Scientific公司；低温高速离心机、微量移液枪购自德国Eppendorff公司；倒置荧光显微镜购自日本Olympus公司；流式细胞仪购自美国Beckman公司。

1.4 方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定 C57BL/6小鼠腹腔注射苯巴比妥钠(45 mg/kg)麻醉处死后取出股骨，用含有青霉素和链霉素的磷酸盐缓冲液溶液反复冲洗，用无菌钳夹碎股骨两端，用骨髓间充质干细胞培养基反复冲洗骨髓腔，冲洗液过滤后以1 500 r/min离心10 min弃上清，加入含体积分数10%胎牛血清的 DMEM培养液重悬细胞，以1×10¹⁰L^-1的细胞浓度将细胞接种于培养瓶，于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养。48 h后更换培养液，以后每3 d更换1次，细胞长满至85%时，利用骨髓间充质干细胞消化液(0.25%胰酶+0.02%EDTA)进行消化，离心收集细胞后传代，收集第3代细胞用于后续实验。利用流式细胞仪通过CD90和CD105表面抗原进行鉴定。

1.4.2 Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞及稳定转染细胞株筛选 取对数生长期的第3代骨髓间充质干细胞接种于6孔板，细胞长满至60%时，用感染复数为50的Lenti-Runx2-EGFP慢病毒(Runx2组)转染细胞，同时转染不含Runx2基因的慢病毒(阴性对照组)，以及未用慢病毒转染的正常培养细胞作为空白对照组。转染48 h后，在荧光显微镜下观察各组细胞绿色荧光蛋白的表达情况，先在白光视野下计数细胞总数，再在荧光视野下计数表达荧光的细胞数目，转染效率=(荧光表达细胞数目/白光视野细胞总数)×100%，取10个视野，计算平均值。

取转染后的骨髓间充质干细胞接种于6孔板，加入不同质量浓度(0，1，2，3，4，5 mg/L)的嘌呤霉素，选择在10-14 d内让全部细胞死亡的最低浓度作为最佳筛选浓度。另取转染后的骨髓间充质干细胞接种于6孔板，孵育24 h后加入最佳筛选浓度的嘌呤霉素，每隔2 d更换新的含最佳筛选浓度嘌呤霉素的培养液，连续培养10 d。收集抗性细胞，获得稳定转染细胞株。

1.4.3 骨性关节炎小鼠模型制备、分组和干预 将C57BL/6小鼠膝关节前交叉韧带切断以建立骨性关节炎模型^[13]，建模2周后将30只小鼠随机分为3组，每组10只。Runx2转染骨髓间充质干细胞组(n=10)膝关节腔内注射0.1 mL含1×10⁷个Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞的生理盐水；单纯骨髓间充质干细胞组(n=10)注射0.1 mL含1×10⁷个单纯骨髓间充质干细胞的生理盐水；生理盐水组(n=10)注射0.1 mL生理盐水。

1.4.4 膝关节X射线片检查、软骨组织形态观察和免疫组织化学检测 移植2周后，所有小鼠行侧位X射线片检查；之后处死各组小鼠，取膝关节软骨组织，行甲苯胺蓝染色，观察软骨组织形态，并根据Mankin's评分标准对软骨组织情况进行评分；另取膝关节软骨组织，行免疫组织化学检测Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白表达，所有操作按照免疫组化试剂盒说明进行。

1.4.5 反转录PCR检测 取膝关节滑膜组织，Trizol法提取总RNA，A₂₆₀/A₂₈₀比值1.8-2.0提示样品RNA满足实验要求，按反转录试剂盒操作反转录成cDNA，进行PCR扩增分析，引物委托上海吉玛公司合成，Runx2上游：5'-TCT TCC CAA AGC CAG AGC G-3'，下游：5'-TGC CAT TCG AGG TGG TCG-3'。骨形成蛋白2上游：5'-GCG TGC TTC TTA GAC GGA CTG-3'，下游：5'-CGT CAG AGG GCT GGG ATG-3'。碱性磷酸酶上游：5'-GTC CCA CAA GAG CCC ACA AT-3'，下游：5'-CAA CGG CAG AGC CAG GAA T-3'。骨钙素上游：5'-CAG TAA GGT GGT GAA TAG ACT CCG-3'，下游：5'-GGT GCC ATA GAT GCG CTT G-3'。骨桥蛋白上游：5'-TGG ATG AAC CAA GCG TGG A-3'，下游：5'-TCG CCT GAC TGT CGA TAC CA-3'。β-actin上游：5'-CTG TGC CCA TCT ATG AGG GTT ACG-3'，下游：5'-CAT AGA GGT CTT TAC GGA TGT CAA CG-3'。扩增体系50 μL：Taq酶1 μL、Taq buffer 5 μL、MgCl₂ 3 μL、dNTP 1 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板1 μL、ddH₂O 37 μL。扩增条件：94 ℃/5 min，(94 ℃/30 s、55 ℃/30 s、72 ℃/60 s)，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad分析系统扫描分析，目的基因表达水平=目的基因吸光度值/ β-actin吸光度值。

1.4.6 蛋白印迹法检测 取膝关节滑膜组织，提取总蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。等量总蛋白上样，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转至聚偏氟乙烯膜。TBST漂洗，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔抗鼠一抗工作液(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST漂洗，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗工作液(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h。TBST漂洗，暗室内二氨基联苯胺显色、曝光。Bio-Rad分析系统扫描分析，目的蛋白表达量=目的蛋白吸光度值/GAPDH吸光度值。

1.5 主要观察指标 ①膝关节退变情况和软骨组织形态；②膝关节软骨组织Ⅱ型、Ⅹ型胶原蛋白表达水平；③滑膜组织中骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白mRNA的表达水平。

1.6 统计学分析 采用IBM SPSS 19.0统计学软件分析数据，所有实验数据均取5次实验结果的平均值，计量资料以x(_)±s表示，多组间比较采用方差分析，组内两两比较采用LSD-t 检验，取双侧a < 0.05为检测水准，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

中国目前约有1.5亿骨性关节炎患者，其中50%-70%的患者急需治疗。所以探索骨性关节炎的发病机制，寻找延缓或阻止其发生、发展的治疗靶点，对于疾病的早期防治至关重要。从解剖学特点来看，关节软骨内无血管、淋巴管和神经支配，主要靠关节腔内的滑膜液维持营养，所以损伤后较难修复^[14-15]。近年来骨组织工程技术的快速发展为骨性关节炎的治疗带来了希望，其中骨髓间充质干细胞是骨组织工程中首选的种子细胞。

骨髓间充质干细胞具体是指骨髓基质内的非造血干细胞来源的细胞亚群，可在多种因素的诱导下分化为成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞等^[16-17]。目前体外诱导骨髓间充质干细胞分化的因素主要包括化学、物理和细胞生长因子等^[18-24]：化学因素主要包括地塞米松、活性维生素D、β-甘油磷酸钠、雌激素和抗坏血酸等；物理因素主要包括体外冲击波法和脉冲电磁场法等；有关细胞生长因子对骨髓间充质干细胞的诱导分化研究最多，骨形成蛋白2、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子等细胞生长因子都可以明显诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞分化、成熟，在骨发育和再生修复中发挥重要作用。但是生物因子属蛋白分子，进入人体内后易发生降解，延长外源性细胞生长因子在骨缺损处的作用时间是影响骨修复的关键因素，也是骨组织工程亟需解决的难题。

人类Runx2基因位于人类常染色体6p21位点，属于runt域基因家族的转录因子之一。Ducy等^[25]研究证实，Runx2能够激活骨钙素、骨桥蛋白等成骨相关基因的表达，诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，进一步的研究发现，在小鼠交配后12.5 d的胚胎发育期内可见颅骨、躯干骨和四肢骨的骨髓间充质干细胞存在Runx2表达，而在已分化了的软骨细胞中检测不到。Komori等^[26]通过RNA干扰技术构建了Runx2基因缺陷模型小鼠，结果发现，模型小鼠子代出生后完全没有骨化组织形成，整个软骨膜区无血管和间充质细胞的侵入，无法骨化。Enomoto等^[27]研究显示，Runx2基因缺陷小鼠无法形成成骨细胞；即使有骨形成蛋白2存在，Runx2基因缺陷的骨髓间充质干细胞仍无法向成骨细胞分化，但是保留了部分向软骨细胞分化的能力，然而软骨细胞的成熟仍受严重影响。以上结果说明Runx2是诱导骨髓间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞分化、成熟的关键转录因子，在骨修复与重建中发挥重要作用。

骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常低，仅为0.001%-0.01%，且成骨能力较弱，必须进行体外诱导后才能应用于组织工程的修复^[28-29]。所以作者设想通过过表达骨髓间充质干细胞中Runx2的表达，增加其向成软骨细胞和成骨细胞分化、成熟的能力。慢病毒载体是调控生物基因表达与功能最常用的载体系统，能够将目的基因完整的整合至靶细胞，实现长期稳定的表达，具有转染效率高、免疫反应小等优点，该技术目前已成为研究基因功能和实现基因治疗的重要手段^[30-31]。为此作者选择了Runx2慢病毒载体，通过慢病毒感染体外培养的骨髓间充质干细胞将外源性Runx2基因整合至细胞。结果发现，慢病毒转染48 h后，Runx2组和阴性对照组转染效率分别为(88.57±3.07)%和(89.43±2.09)%，并经最佳浓度的嘌呤霉素(4 mg/L)筛选得到了稳定转染细胞株，Runx2组Runx2 mRNA表达显著高于阴性对照组和空白对照组。提示外源性Runx2基因已成功整合至骨髓间充质干细胞，并能够稳定表达Runx2。

为探讨Runx2高表达骨髓间充质干细胞对骨性关节炎关节损伤的修复能力，实验构建了骨性关节炎小鼠模型，通过向膝关节腔内注射Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞，观察其在关节损伤修复中的作用。X射线检查发现Runx2转染骨髓间充质干细胞组软骨完整，未见明显退化，关节面平整；甲苯胺蓝染发现Runx2转染骨髓间充质干细胞组染色最深，软骨细胞多，软骨层厚，Mankin's评分显著低于其他2组；免疫组织化学检查发现Runx2转染骨髓间充质干细胞组Ⅱ型胶原蛋白阳性率显著大于其他2组，而X型胶原蛋白阳性率显著小于其他2组；进一步对膝关节滑膜组织的检测发现Runx2转染骨髓间充质干细胞组Runx2、骨形成蛋白2、碱性磷酸酶、骨钙素和骨桥蛋白表达显著高于其他2组。结果说明Runx2转染骨髓间充质干细胞具有很强的关节病变软骨修复能力，其作用要强于单纯骨髓间充质干细胞。

综上所述，Runx2慢病毒转染骨髓间充质干细胞能够促进骨性关节炎关节损伤修复，从而为骨性关节炎的临床治疗提供新的方向。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程