构建靶向Runx2基因成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0951

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
颅骨锁骨发育不全(cleidocranial dysplasia，CCD)：是一种广泛累及包括锁骨、颅骨在内的整个骨骼系统的常染色体显性遗传性疾病(MM119600)，出生发病率约为1∶100 000；研究表明RUNX2基因杂合突变、基因插入、缺失等是造成颅骨锁骨发育不全的重要原因。
Runx2基因：Runx相关因子(runt-related gene，Runxx)是一类转录因子蛋白的统称，主要有Runxl、Runx2和Runx3，其中 Runx2基因位于人类常染色体的6p21，长约220 kb，包括8个外显子，具有和其它家族成员相似的Runt结构域，是骨发育过程中调节骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化和成熟最关键的转录因子。

摘要
背景：研究表明成骨细胞特异性转录因子(Runx2)的杂合突变、基因插入、缺失等是造成颅骨锁骨发育不全的重要原因。目前关于Runx2基因沉默后成骨细胞功能会发生怎样的变化，及如何沉默成骨细胞Runx2基因表达的相关研究未见报道。
目的：构建靶向Runx2基因的小鼠成骨样细胞MC3T3-E1慢病毒载体，为颅骨锁骨发育不全的研究提供实验依据。
方法：根据预实验结果在含5 mg/L Polybrene的ENi.S培养液中，病毒按MOI=40进行感染，按病毒序号分为4组：NC组：pFU-GW-016PSC53349-1；KD1组： LVpFU-GW-016PSC60107-1；KD2组：LVpFU-GW-016PSC60108-1；KD3组：LVpFU-GW-016PSC60109-1。转染后16 h换液，72 h后，Celigo全视野细胞扫描分析仪观察检测基因的表达情况；两步法进行Real-Time PCR检测Runx2基因的沉默效果。
结果与结论：①病毒转染后72 h，NC组未见荧光表达；KD1组可见少量荧光表达；KD2组荧光表达增强；KD3组可见强绿色荧光；②Real-Time PCR结果提示KD3组获得较好Runx2基因沉默效果；③实验成功构建靶向Runx2基因的MC3T3-E1细胞慢病毒载体，筛选出特异性抑制成骨细胞Runx2基因的病毒，并初步确定其作用的时间、相应的计量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-9586-1281(秦晗)

关键词: 组织构建, Runx2基因, MC3T3-E1细胞, 慢病毒, 转染

Abstract:

BACKGROUND: Heterozygous mutation, gene insertion and gene deletion of Runt-related transcription factor 2 (Runx2) have been found to be important causes of cleidocranial dysostosis. However, there is a lack of studies on the changes of osteoblasts after Runx2 silencing and how to perform gene silencing.
OBJECTIVE: To construct the lentiviral vector targeting Runx2 gene in mouse osteoblast-like cells (MC3T3-E1), so as to provide experimental basis for the research of cleidocranial dysostosis.
METHODS: According to the preliminary experimental results, the lentiviral vector was infected by MOI=40 in the ENi.S medium containing 5 mg/L Polybrene for 10 hours, and divided into four groups according to the viral number: group NC: pFU-GW-016PSC53349-1; group KD1: LVpFU-GW-016PSC60107-1; group KD2: LVpFU-GW-016PSC60108-1 and group KD3: LVpFU-GW-016PSC60109-1, then replaced with conventional medium at 16 hours after infection. The target gene expression was detected by Celigo® Image Cytometer at 72 hours after transfection. The two step method of real-time PCR was utilized to detect the silencing effect of Runx2 gene.
RESULTS AND CONCLUSION: At 72 hours after transfection, there was no green fluorescence in the group NC; a small amount of fluorescent expression in the group KD1; enhanced fluorescence expression in the group KD2 and obvious green fluorescence in the group KD3. Real-time PCR curves showed the better silencing effect of Runx2 gene in the group KD3. In summary, we successfully constructed the lentiviral vector targeting Runx2 gene into MC3T3-E1 cells, screened the virus inhibiting Runx2 gene, and clarified the action time and related measurement.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Genes, Osteoblasts, Lentivirus, Transfection, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计细胞学实验观察。

1.2 时间及地点实验于2017年3至7月在徐州医科大学附属连云港医院完成。

1.3 材料胎牛血清(Ausbian)、DMEM(Corning)、胰酶(上海生工)、Puromycin(Clontech )、D-Hanks(上海吉凯)、Trizol(上海普飞)、M-MLV (promega)、dNTPs(promega)、oligo dT(上海生工)、Bulge-Loop^TM miRNA qPCR Primer Set(广州锐博)、Rnase Inhibitor(promega)、Primer(R&F) (上海吉凯)、SYBR Master Mixture (TAKARA )、Nanodrop 分光光度计(Thermo)、稳压电泳仪(上海天能)、超细匀浆机(FLUKO公司)、Celigo (Nexcelom)、Real time PCR 仪器(Roche)、反转录耗材(Axygen)、CO₂培养箱(日本三洋)、倒置显微镜(上海蔡康)、离心机(赛默飞世尔)、生物安全柜(上海振样创)。

1.4 实验方法
1.4.1 准备目的细胞从液氮罐中取出小鼠成骨细胞MC3T3-E1(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)冻存管，迅速放入37 ℃水浴中，并不时摇动使其尽快解冻。完全解冻后，1 300 r/min，离心3 min，体积分数75%的乙醇擦拭冻存管消毒后，移至生物安全柜。吸去冻存液上清，加入1 mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有3 mL完全培养基的6 cm dish中，轻轻晃匀后置于37 ℃、体积分数5% CO₂培养箱。24 h后更换1次培养液继续培养，待细胞汇合度达80%左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。

1.4.2 目的细胞慢病毒感染处于对数生长期的细胞胰酶消化，完全培养基制成(3-5)×10⁷L ^-1细胞悬液，接种相应的细胞数到培养板中，继续培养保证感染时铺板量达到15%-30%。按照预实验结果，更换含5 mg/L Polybrene的ENi.S感染培养基。病毒按MOI=40进行感染，按病毒序号分为4组：

NC组：pFU-GW-016PSC53349-1；

KD1组：LVpFU-GW-016PSC60107-1；

KD2组：LVpFU-GW-016PSC60108-1；

KD3组：LVpFU-GW-016PSC60109-1。

感染后16 h更换为常规培养基继续培养。观察感染后细胞状态良好，未出现大量死亡现象，特别是保证NC组与其他组细胞状态相当。感染后72 h左右，Celigo全视野细胞扫描分析仪观察被检基因的表达情况，荧光率即为阳性感染率。

1.4.3 荧光实时定量(QPCR)检测Runx2 mRNA水平表达情况收集细胞，2 000 r/min离心5 min，去上清，细胞沉淀中加入1 mL Trizol，充分混匀后室温静置5 min，然后转移至新的1.5 mL EP管中。反转录获得cDNA(使用Promega M-MLV试剂盒)，将1 μL Oligo dT(0.5g/L)和2.0 μg Total RNA加入到PCR小管中，补充RNase-Free H₂O至10 μL；混匀后离心，70 ℃温浴10 min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火。在上述混合物中，按比例配制反应体系(冰上进行)，混匀，短暂离心，上述体系在 42 ℃水浴反应1 h，然后在70 ℃水浴10 min 使 RT酶失活，将得到的RT产物cDNA 置于-20 ℃保存备用。两步法进行Real-Time PCR，并制作熔解曲线，数据分析。内参基因和目的基因引物由吉凯基因设计与合成。

1.5 主要观察指标 ①Celigo观察病毒转染的表达，荧光率即为阳性转染率；②Real-Time PCR检测Runx2基因的沉默效果。
1.6 统计学分析应用SPSS 13.0统计软件对实验组和对照组数据进行t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

颅骨锁骨发育不全的发病机制及治疗一直是口腔领域研究的热点^[8-11]，但目前有限的治疗就是对萌出延迟的牙齿采取正畸和修复治疗，这只能给部分患者提供较少的疗效^[10-11]。由于基因治疗和组织工程技术的联合应用模仿了牙齿萌出的自然发育过程，在牙齿萌出过程中已有不少研究^[12-15]。可以预测未来的治疗方案应该包括牙齿的重新萌出，解决这一问题的关键就是明确牙齿萌出异常的类型和原因，在分子水平上找到发病的根源从而采取相应的治疗。

目前较多文献认为成骨细胞特异性转录因子(Runx2)的杂合突变、基因插入、缺失等是造成颅骨锁骨发育不全的重要原因^[4-7]。然而，关于Runx2基因的表达调控、其诱导成骨细胞的分子机制以及Runx2基因沉默后成骨细胞功能变化的相关研究较少。因此该实验拟通过构建靶向Runx2基因的MC3T3-E1细胞慢病毒载体，进而进行Runx2基因沉默后成骨细胞功能变化及牙齿萌出障碍动物模型的相关实验研究，以期为颅骨锁骨发育不全的病因学研究提供帮助。

从遗传学中心法则看，沉默基因表达的方法无外乎两个方面：基因组DNA水平和RNA水平^[16-17]。DNA水平基因沉默的常用方法包括构建基因重组打靶载体、反义寡核苷酸技术、甲基化寡核苷酸技术等^[18-20]。其中出现最早最成熟的技术就是基因敲除，即构建基因重组打靶载体。它是根据同源重组的原理，利用分子生物学技术减弱甚至灭活某特定靶基因表达水平，然后观察实验动物整体功能状态的变化，推测靶基因的功能。基因敲除的优点是基因灭活效果确切可靠，缺点是技术复杂，费时费力。RNA水平的研究指RNA干扰，是指由外源或内源性的双链RNA(doubles trand RNA，dsRNA)导入细胞而引起的与dsRNA同源的mRNA降解，进而抑制相应的基因表达，是目前抑制哺乳动物细胞基因表达的有效方法。RNA干扰出现的时间不长却发展迅速，相对基因敲除技术，RNA干扰技术在操作上相对简单，且基因沉默灭活效果可靠^[21-23]。该实验Runx2基因沉默采用RNA干扰技术，通过外源慢病毒转染，沉默小鼠成骨样细胞MC3T3-E1的Runx2基因表达。成功构建靶向Runx2基因的MC3T3-E1细胞慢病毒载体，为后期研究Runx2基因在颅骨锁骨发育不全疾病发生过程中分子信号转导机制及其时空表达奠定基础。

由于细胞的种属、代数及活性的不同，病毒对细胞的亲嗜性也会不同，在预实验中作者按转染条件分为4组：Normal Medium组：在目的细胞正常培养基，即完全培养基中感染病毒；Polybrene组：在含5 mg/L Polybrene的正常培养基中感染病毒；Eni.S组：在Enhanced Infection Solution(ENi.S.)中感染病毒；Eni.S+Polybrene组：在含 5 mg/L Polybrene的ENi.S中感染病毒，而后按感染MOI分4组：MOI 1病毒按MOI=1进行感染；MOI 10病毒按MOI=10进行感染；MOI 40病毒按MOI=40；MOI 100病毒按MOI=100进行感染，预实验结果显示对于小鼠成骨样细胞MC3T3-E1而言，在含5 mg/L Polybrene的ENi.S培养基中，病毒按MOI=40更容易被转染。根据预实验条件将MC3T3-E1细胞进行慢病毒感染，按病毒序号分4组：NC组、KD1组、KD2组和KD3组。感染后16 h换液，72 h进行荧光拍照，结果显示各组细胞状态良好，未出现大量死亡现象，荧光标记慢病毒感染显示NC组：未见荧光表达；KD1组：可见少量荧光表达。KD2组：荧光表达增强；KD3组：可见强绿色荧光。Real-Time PCR结果提示同对照组相比，KD3组获得较好Runx2基因沉默效果。通过该实验，作者筛选出特异性抑制成骨细胞Runx2基因的病毒，并初步确定其作用的时间、相应的计量，可作为后期实验的重要参考。

近年来在牙齿发生、发育领域的工作扩展了研究者对牙齿萌出过程的认识，将这一过程中的关键调节因子作为治疗和预防的作用靶点，可为颅骨锁骨发育不全的最新诊断和治疗奠定基础，而要实施精确有效的位点打击，就需深入了解其内在机制^[24-25]。体内外实验均表明Runx2是成骨细胞分化的关键基因，它通过作用于多条信号转导通路及多种调节蛋白影响多个成骨特异性基因表达而参与成骨细胞分化^[26-28]，但Runx2基因的表达调控及其诱导成骨细胞分子机制目前尚未彻底清楚。此次实验成功构建靶向Runx2基因的小鼠成骨样细胞慢病毒载体，为后期进一步研究Runx2基因沉默后成骨细胞的功能变化及构建牙齿萌出障碍动物模型的相关实验研究提供理论依据。同时也为译解Runx2基因在颅骨锁骨发育不全疾病发生过程中分子信号转导的相关机制打开新的思路，进而更好的了解牙齿萌出过程中骨量动态平衡调节机制，为阐明牙齿萌出障碍的可能病因及寻找相应治疗方法提供实验基础。当然由于该部分研究仅是课题的前期实验部分，因此研究不够深入，并没有进行Runx2基因沉默后小鼠成骨样细胞相关因子变化及细胞分化功能的研究，以及未能在动物模型上进一步体内观察成骨细胞分化功能的变化情况，这都将是下一步重点研究的内容。

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