敲降Gata6基因雄性小鼠模型睾丸功能维持过程中的调控机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0831

摘要/Abstract

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文题释义：
CRISPR/Cas9技术：CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
转录因子：转录因子(transcription factor)是一群能与基因5’端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

摘要
背景：GATA家族是一类含有两个保守锌指结构的转录调节因子，在人和脊椎动物中广泛表达，同时该家族参与调节组织发育、分化和细胞增殖过程。Gata6属于GATA家族中的一员，其在哺乳动物的心脏、性腺、脾脏、肝、性腺等器官发挥重要功能。
目的：分析Gata6基因在小鼠睾丸中的作用机制。
方法：以小鼠为模型，通过CRISPR/Cas9技术在雄性小鼠体内敲降Gata6基因，并以正常小鼠做对照，组织学观察睾丸形态学变化，Ellisa法测定雄激素相关合成酶，实时定量PCR仪检测相关基因。
结果与结论：①利用CRISPR/Cas9技术成功在小鼠体内敲降Gata6基因；②与对照组相比，2月龄敲降组小鼠睾丸发育迟缓，睾丸及相关生殖器明显变小，精原细胞和精子生成减少，睾丸中雄性信号通路相关基因表达量降低，雄激素水平显著降低(P < 0.05)；③结果说明，Gata6在哺乳动物睾丸发育过程中发挥重要作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0003-2088-9903(王澍弘)

关键词: 组织构建, Gata6基因, 基因敲降, 生殖发育

Abstract:

BACKGROUND: The GATA transcription factors have two conserved zinc fingers, which are widely distributed in human and vertebrates. This family plays a significant role in tissue development, differentiation and cell proliferation. Especially, Gata6 exerts important effects on heart, gonad, spleen, and liver in mammals.
OBJECTIVE: To study the mechanism of Gata6 gene in mouse testes.
METHODS: Gata6 was knocked down in male mice aged 2 mouths by CRISPR/Cas9 technique, and normal mice were as controls. Histological changes of the mouse testis were observed. Androgen-related synthase levels were detected by ELISA and real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Gata6 was knocked down successfully in mice by CRISPR/Cas9 technique. Testicular developmental retardation, size-reduced testicles and related genitalia, and decreased spermatogonia and spermatogenesis were detected in the knockdown group compared with the control group. The levels of testosterone and androgen-related gene were significantly lower in the knockdown group than the control group (P < 0.05). To conclude, Gata6 plays an important role in mammal testicular development.

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Key words: Genes, Mice, Knockout, Reproduction, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王顺德，李晶，王澍弘. 敲降Gata6基因雄性小鼠模型睾丸功能维持过程中的调控机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(24): 3857-3862.

Wang Shun-de, Li Jing, Wang Shu-hong. Regulatory mechanism underlying testicular maintenance in a mouse model of Gata6 gene knockdown[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(24): 3857-3862.

图/表（结果） 1

2.1 Gata6 敲降序列选择及突变检测将靶序列选择在Gata6的第一个外显子上，靶序列为：GGC GCC TTC ATG CAC AGC GCG GG，酶切位点为AlwI。提取小鼠尾巴基因组DNA，扩增DNA片段，用AlwI限制性内切酶进行酶切。在对照组相比较，AlwI能切开成2明显的DNA条带，一条322 bp，另一条140 bp，而敲降组大部分条带未被切开。将敲降组未切开条带回收、测序，测序得到的序列与对照组相比较，结果显示在22个测序样品共有10个中出现2-103个碱基不同程度的缺失或者插入(图1)。

2.2 小鼠Gata6敲降后表达通过实时定量PCR技术和蛋白免疫印迹检测敲降组和对照组小鼠Gata6表达量，在敲降组中发现Gata6的表达量不论基因水平(图2A)还是蛋白水平(图2B)都显著性降低。

2.3 Gata6基因敲降影响睾丸的发育结果与对照组睾丸相比，2月龄Gata6基因敲降阳性小鼠睾丸与肛门的距离更短(图3A，B)；睾丸和相关生殖器官的大小显著性降低(图3C，D)。

组织学观察(苏木精-伊红染色)发现，敲降阳性小鼠个体的精巢发育不完整，出现明显的空腔，精原细胞明显减少(图3E，F)。

2.4 Gata6缺失对小鼠相关雄性相关信号通路中基因的影响取2月龄雄性敲降小鼠和正常小鼠睾丸，提取RNA，反转录成cDNA，通过实时荧光定量PCR方法检测生殖细胞和体细胞相关基因变化情况。如图4所示，与正常对照组相比，敲降组小鼠睾丸中与减数分裂和精原细胞相关的标记基因表达量显著性降低(Stra8，Vasa，Tnp1，Spo11)，同时，与体细胞相关的标记基因表达量也显著性降低(Sox9，17HSDb3，Dmrt1)，但是Cx30.2和Dazl基因无显著性变化(图4)。

2.5 Gata6缺失对小鼠激素水平的影响采用酶联免疫法(EIA)检测2月龄Gata6基因敲降阳性小鼠雄激素(11-KT)水平，结果显示，Gata6基因敲降阳性小鼠雄性个体雄激素水平与对照组雄性个体相比显著降低(图5)。

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引言

材料方法

1.1 设计分组对照动物观察。

1.2 时间及地点实验于2015年3月至2016年6月在重庆三峡中心医院中心实验室地点完成。

1.3 材料 SPF级8周龄C57，KM小鼠，来自重庆医科大学动物研究所引进，许可证号SCXK(YU)2012-0001。小鼠饲养于重庆三峡中心医院中心实验室，12 h∶12 h照明，食物与饮水充足，SPF环境。NcoI、AlwI、Xba I限制性内切酶、T₄DNA连接酶、Q5PCR聚合酶、dNTPs均购自NEB公司，体外转录T7试剂盒购自Takara公司，T7 mMESSAGE mMACHINE^® Kit试剂盒购自invitrogen公司，感受态细胞购自天根公司。

1.4 实验方法

1.4.1 Gata6 CRISPR/Cas9靶序列及RNA的合成根据CRISPR/gRNA靶序列设计网站(http://zifit.partners. org/ZiFiT/)设计Gata6靶序列。设计靶序列的一般原则：①长度18-23个碱基，以GG开头(反向为CC)，NGG结束；②在NGG附近设计酶切位点；③靶序列最好靠近5’端的重要氨基酸上；④具有特异性，防止脱靶^[10-11]，最终作者设计的Gata6的靶序列为：GGC GGG GAT CGC GGT CCC TGC GG。

RNA的合成：包括gRNA的合成和Cas9 mRNA的合成，根据RNA相应的合成步骤来合成RNA用于注射^[10]。

1.4.2 Gata6基因敲降验证将合成的gRNA和Cas9 mRNA按照体积1∶1混合后注射到小鼠的单细胞受精卵中，使其最终浓度分别为25 mg/L和20 mg/L，然后将射后的受精卵立即移植进假孕的母鼠中。待小鼠出生后7 d，提取小鼠尾巴的基因组DNA进行PCR扩增、电泳、测序来最终验证CRISPR/Cas9的活性。

1.4.3 检测2月龄基因敲降小鼠睾丸Gata6的表达及睾丸发育将2月龄敲除小鼠麻醉下用颈椎脱臼法处死，取其睾丸，按照常规方法提取细胞总RNA和总蛋白，将RNA反转录成cDNA。通过实时定量PCR和蛋白免疫印迹(Western Blot)检测敲降小鼠中Gata6的表达量，并以正常小鼠做对照。

将2月龄敲降小鼠麻醉下用颈椎脱臼法处死，取其睾丸，置于波恩氏液中过夜固定，常规石蜡包埋、切片，厚度为5 μm，苏木精和伊红显色，光学显微镜下观察性腺组织学变化。

1.4.4 实时定量PCR仪检测相关基因表达量将cDNA为模板，β-actin为内参基因进行实时定量PCR，检测2月龄敲降小鼠睾丸中Stra8，Vasa，Dazl，Tnp1，Spo11，Sox9，17HSDb3，Dmrt1基因的表达(引物序列见表1)。

表1 引物序列

Table 1 Primer sequences

名称	引物序列(5’到3’)	引物作用
Gata6-Knockdown	GGC GGG GAT CGC GGT CCC TGC GG	靶序列
Gata6-F	GGC TGG TGC CTG CCA AAG C	检测工作引物
Gata6-R	CTC GCC GCC CTG TCC AGC CAG
gRNA-F	TAA TAC GAC TCA CTA TAG GCA GCT TCG GGT TCT TTC CGT TTT AGA GCT AGA AAT AGC	合成gRNA引物
gRNA-R	AGC ACC GAC TCG GTG CCA C
Gata6-qF	CAG CGC GGG AGC CCT CCT CG	定量PCR引物
Gata6-qR	GTG GCG GGA CCT CCG GGC CG
Stra8-qF	GGT GGT CCG CAG ACG CCT GTC
Stra8-qR	GCA GGT ACT GAA TAG GAC AAA G
Vasa-qF	GGG AAG AGT GGA GAG CTG AC
Vasa-qR	CTG CAG CAT TCG ACA GAA AT
Dazl-qF	ACA TCC CAC AGC ACA AGT TGA C
Dazl-qR	CTG CCT CAA GCT GAC CAT AAA G
Tnp1-qF	GAC CAG CCG CAA GCT AAA GAC
Tnp1-qR	CGA TGA TGC AAG TCG CAA TTA C
Spo11-qF	CGA CAC TTA TGC AAC CAA GAG
Spo11-qR	CGT GCT ATC TAC TTC CAA GG
Sox9-qF	CGA AGA GGC CAC GGA ACA G
Sox9-qR	GAT CTG AAG CGA GAG GG
17HSDb3-qF	CAA GTG CGG AGG AAT CGA
17HSDb3-qR	CGA ACT TCC ACA GAG CGA TA
Dmrt1-qF	CAC CCA GCT GCA GTA CAC GTA T
Dmrt1-qR	TCA AAG GTC AAC GTG ATT GTT CC

1.4.5 雄激素水平测定分别收集Gata6 2月龄敲除小鼠和对照小鼠血液，离心后分离血清，采用雄激素(11- ketotestosterone)EIA Kit(Cayman, USA)试剂盒检测血清中雄激素的水平。

1.5 主要观察指标 ①Gata6敲降序列选择及突变检测结果；②小鼠Gata6敲降后表达；③Gata6基因敲降影响睾丸的发育结果；④Gata6缺失对小鼠相关雄性相关信号通路中基因的影响；⑤Gata6缺失对小鼠激素水平的影响。

1.6 统计学方法采用SPSS 17.0进行统计分析，每个结果的样本量最少为6个，定量PCR各自做了6个生物重复和3个物理重复，用△CT法计算结果，然后统计校正随机误差。

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讨论

研究表明，哺乳动物的生殖发育是一个复杂的过程，通过体内关键基因或转录因子来调控相关信号通路，进而影响哺乳动物雌性或雄性的生殖与发育^[12-18]。

相关研究证明，Sry8基因是哺乳动物调控生殖发育的关键基因，在雄性中Sry8促进视黄酸分解酶基因Cyp26b1的表达，导致RA的水平降低，无法激活减数分裂的标记基因Stra8的表达，减数分裂延迟到出生后，发育成为雄性，相反，在雌性中无Sry8基因表达，RA水平升高，Stra8表达激活，减数分裂提前到胚胎期，发育成雌性^[19-22]。

越来越多的研究证明哺乳动物的生殖发育是通过其体内一系列转录因子和生长因子组成的级联调控网络相互作用调控的。例如，在哺乳动物，Sry基因是调控性别决定和分化的关键基因，能够激活下游一系列雄性特异转录因子Sox9，Fgf9等，这些转录因子调控合成相应的雄激素，进而发育成雄性^[23-28]。因此，哺乳动物中相关转录因子的功能越来越受到人们的重视。

在小鼠中，Gata6作为小鼠体细胞的标记基因，其对小鼠精巢的生长与发育具有重要功能，能够影响精巢发育，促进间质细胞和精原细胞增生，合成雄激素^[29-38]。通过表达发现，小鼠的Gata6特异大量表达在雄性精巢中，该定位暗示Gata6基因可能在小鼠精巢的发育过程中起着重要作用。
长期以来由于技术瓶颈，基因的功能研究一直都停留在克隆和表达的层面，功能研究大部分也仅仅停留在体外研究，极大的限制了对许多重要基因的功能认知。CRISPR/Cas9介导的基因靶向修饰技术的出现是对传统基因功能研究技术的变革，它具有特异性强，操作简便，高效的特点^[10]。

此次研究在小鼠中用CRISPR/Cas9基因敲除技术对Gata6基因进行编辑，来研究Gata6基因在小鼠睾丸中的功能。已经成功的在小鼠体内通过CRISPR/Cas9技术敲降了Gata6基因，并且成功的得到了验证。在2月龄时，雄性小鼠已经性成熟，因此对2月龄敲降小鼠进行相关检测分析。结果显示，在2月龄时敲降小鼠雄性个体的睾丸发育阻滞，睾丸及相关生殖器发育缓慢，体细胞大量缺失，出现大量的空泡，精原细胞和精子的生成受阻，这一结果表明Gata6对睾丸的发育是至关重要的，Gata6可能通过体细胞内相关通路来促进相关因子或者激素的合成，从而影响睾丸的发育和精子生成。实时定量PCR和EIA检测更进一步证实了Gata6的关键作用，Gata6基因敲降导致小鼠体细胞的标记基因Sox9，17HSDb3，Dmrt1及精原细胞和减数分裂的标志基因Stra8，Vasa，Tnp1，Spo11的表达降低，同时雄激素11-KT的水平显著下降，进而影响了精原细胞精子的生成。这些研究表明，Gata6通过促进体细胞中相关雄性关键基因的表达，从而促进睾丸的发育。可能由于Dazl是哺乳动物后期精子形成的标志，而作者只检测到2月龄的小鼠，因此Dazl的表达没有变化，有待后续检测。

综上所述，Gata6能够促进哺乳动物睾丸中体细胞的增殖，影响相关雄性信号通路中基因的表达，促进生殖细胞和精子的生成，因此，Gata6在哺乳动物睾丸生殖发育过程中具有重要的功能。

此次研究由于小鼠Gata6敲除是嵌合体，没有真正的进行纯合敲除，所以还不能很肯定表述Gata6在小鼠睾丸中的具体功能，但是此研究可以更进一步了解到Gata6在雄性小鼠睾丸功能维持过程中的相关机制，有利于深入研究Gata6在哺乳动物发育过程中的作用^[39-42]。

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