降钙素基因相关肽调节滑膜间充质干细胞的增殖与成骨分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0667

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
降钙素基因相关肽：是感觉神经末梢释放的神经肽类物质，广泛分布于心血管、消化系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、皮肤及运动系统等组织器官中，在机体许多生理与病理过程中发挥作用。
Wnt信号通路：是一个拥有已知至少19个家族成员的分泌型糖蛋白家族，分经典通路与非经典通路两种，广泛存在于生物体内，具有高度进化保守性，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及迁移等。实验中的Wnt/β-catenin信号通路属于经典Wnt信号通路。

摘要
背景：已有研究证实降钙素基因相关肽可促进滑膜间充质干细胞的增殖与成骨分化，但是涉及其具体作用机制的研究较少。
目的：观察降钙素基因相关肽干预对滑膜间充质干细胞增殖与成骨分化的影响，同时探讨Wnt/β-catenin信号通路在此过程中的作用。
方法：采用胰蛋白酶联合Ⅰ型胶原酶消化法从兔膝关节滑膜组织中分离培养滑膜间充质干细胞。选择第3代滑膜间充质干细胞悬液，分4组培养：空白对照组常规培养，不进行任何干预；实验组加入10^-8 mol/L的降钙素基因相关肽；抑制剂组加入10^-8 mol/L的Wnt信号通路抑制剂DKK-1；联合干预组加入10^-8 mol/L的Wnt信号通路抑制剂DKK-1与10^-8 mol/L的降钙素基因相关肽，干预14 d后进行相关指标检测。
结果与结论：①抑制剂组β-catenin蛋白表达低于空白对照组(P < 0.05)，实验组β-catenin蛋白表达高于空白对照组(P < 0.05)，联合干预组β-catenin蛋白表达高于抑制剂组(P < 0.05)；②培养第3-9天，抑制剂组细胞增殖慢于其余3组(P < 0.05)；培养第5-9天，实验组细胞增殖始终快于空白对照组、联合干预组(P < 0.05)；③实验组碱性磷酸酶活性、矿化结节面积以及骨形态发生蛋白2、Runx2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原基因表达高于其余3组(P < 0.05)，抑制剂组碱性磷酸酶活性、矿化结节面积以及骨形态发生蛋白2、Runx2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原基因表达低于空白对照组(P < 0.05)，联合干预组碱性磷酸酶活性、矿化结节面积以及骨形态发生蛋白2、Runx2、碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原基因表达高于抑制剂组(P < 0.05)；④实验证实降钙素基因相关肽能促进滑膜间充质干细胞的增殖与成骨分化，且Wnt/β-catenin信号通路与其增殖与成骨分化调控密切相关。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-5096-3698(邓睿)

关键词: 滑膜间充质干细胞, 降钙素基因相关肽, Wnt通路, 细胞增殖, 成骨分化, 干细胞

Abstract:

BACKGROUND: It has been proved that calcitonin gene-related peptide can promote the proliferation and osteogenic differentiation of synovial mesenchymal stem cells. However, little is reported on its specific mechanisms.
OBJECTIVE: To investigate the effects of calcitonin gene-related peptide intervention on the proliferation and osteogenic differentiation of synovial mesenchymal stem cells, and to explore the role of Wnt pathway/β-catenin in this process.
METHODS: Synovial mesenchymal stem cells were isolated from synovial tissues of the rabbit knee joint by trypsin and collagenase I digestion. The third generation suspension of synovial mesenchymal stem cells was selected and cultured in four groups. The blank control group was routinely cultured without any intervention. In the experimental group, 10^-8 mol/L calcitonin gene-related peptide was added. In the inhibitor group, 10^-8 mol/L DKK-1, a Wnt signal pathway inhibitor, was added. In the combined intervention group, 10^-8 mol/L calcitonin gene-related peptide and 10^-8 mol/L DKK-1 were added. After 14 days of intervention, related indicator detections were performed.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The expression of β-catenin protein in the inhibitor group was lower than that in the blank control group (P < 0.05); the expression of β-catenin protein in the experimental group was higher than that in the blank control group (P < 0.05); and the expression of β-catenin protein in the combined intervention group was higher than that in the inhibitor group (P < 0.05). (2) The proliferation of cells in the inhibitor group was slower than that in the other three groups at 3-9 days of culture (P < 0.05), while the proliferation of cells in the experimental group was always faster than that in the blank control group and combined intervention group at 5-9 days of culture (P < 0.05). (3) The activity of alkaline phosphatase, mineralized nodule area and mRNA expression of bone morphogenetic protein 2, Runx2, alkaline phosphatase and type I collagen in the experimental group were higher than those in the other three groups (P < 0.05). Compared with the blank control group, the inhibitor groups showed decreased alkaline phosphatase activity, reduced mineralized nodule area as well as reduced expression of bone morphogenetic protein 2, Runx2, alkaline phosphatase and type I collagen, while these indicators were higher in the combined intervention group than the inhibitor group (P < 0.05). To conclude, intervention with calcitonin gene-related peptide can promote the proliferation and osteogenic differentiation of synovial mesenchymal stem cells through the Wnt/β-catenin signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Synovial Membrane, Mesenchymal Stem Cells, Calcitonin Gene-Related Peptide, Cell Proliferation, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

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Deng Rui, Pan Fu-wen, Han Yao-guang. Calcitonin gene-related peptide regulates proliferation and osteogenic differentiation of synovial mesenchymal stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(33): 5321-5326.

图/表（结果） 1

2.1 滑膜间充质干细胞的培养与鉴定结果 采用倒置显微镜观察发现，原代培养的细胞在1 d之后开始贴壁；2 d后可见大量形态各异的细胞，多呈圆形或多角形；三四天后，细胞融合可达80%左右，呈漩涡状排列；传代第3代后，细胞形态逐渐均一，呈梭形，见图1；随着传代次数的增加，细胞形态无明显变化。

选择第3代滑膜间充质干细胞进行流式细胞仪鉴定，发现其表面可高表达CD90、CD105，低表达CD68。

2.2 Western blotting检测β-catenin蛋白表达 与空白对照组比较，抑制剂组β-catenin蛋白表达明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；与空白对照组比较，实验组β-catenin蛋白表达明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)；与抑制剂组比较，联合干预组β-catenin蛋白表达明显升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图2。

2.3 CCK-8法检测细胞增殖 随着培养时间的增加，各组细胞吸光度值逐渐增加；培养第3天，抑制剂组细胞吸光度值低于其余各组，差异有显著性意义(P < 0.05)，其余组间比较差异无显著性意义；培养第5-9天，抑制剂组细胞吸光度值低于空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，实验组细胞吸光度值高于空白对照组、联合干预组，差异有显著性意义(P < 0.05)，联合干预组细胞吸光度值高于抑制剂组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图3。

2.4 茜素红染色结果 成骨诱导分化14 d，茜素红染色观察滑膜间充质干细胞矿化结节生成情况。结果显示各组均有呈橘红色的矿化结节生成(图4)，实验组矿化结节最多且最大，抑制剂组矿化结节最少且最小，空白对照组矿化结节较联合干预组多且大；采用ImageJ软件分析染色面积，实验组矿化结节面积大于其余3组，差异有显著性意义(P < 0.05)，空白对照组矿化结节面积大于抑制剂组、联合干预组，差异有显著性意义(P < 0.05)，联合干预组矿化结节面积大于抑制剂组，差异有显著性意义(P < 0.05)。

2.5 碱性磷酸酶活性 成骨诱导分化14 d，实验组碱性磷酸酶活性高于空白对照组、联合干预组、抑制剂组，差异有显著性意义(P < 0.05)；与空白对照组比较，抑制剂组碱性磷酸酶活性下降，差异有显著性意义(P < 0.05)；与抑制剂组比较，联合干预组碱性磷酸酶活性升高，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.6 RT-PCR检测成骨相关基因表达 成骨诱导分化14 d，RT-PCR检测成骨相关基因碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runx2及Ⅰ型胶原基因表达。结果可见，实验组碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runx2及Ⅰ型胶原基因表达高于空白对照组、联合干预组、抑制剂组，差异有显著性意义(P < 0.05)；抑制剂组碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runx2及Ⅰ型胶原基因表达明显低于空白对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；联合干预组碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runx2及Ⅰ型胶原基因表达明显高于抑制剂组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

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引言

骨是构成人体的主要支架，是人体各种运动的基础。近年来，由于建筑、工业、农业，尤其是车祸创伤等导致的骨折、骨创伤患者逐年增加。骨组织具有强大的自身修复能力，大多数的骨折都会很好愈合，但一部分骨折却难以愈合。当骨折长期不能愈合时，就称为骨不连。目前，修复骨不连、骨缺损的方法主要是通过自体骨移植、同种异体骨移植和骨替代材料移植^[1-3]。同种异体骨材料存在传播疾病与致敏的危险^[4]，自体骨材料存在骨量不足与二次损伤等问题^[5]，骨替代材料可以避免生物源性修复材料的缺陷，但它的成骨能力较弱。因此，近年来组织工程研究为骨组织需求问题带来了新的希望^[6-7]。

种子细胞是组织工程研究的重要内容之一^[8-10]。目前骨研究领域报道较多的是骨髓间充质干细胞。自De Bari等^[11]于2001年首次从滑膜组织中分离出具有多向分化潜能的细胞，后将其命名为滑膜间充质干细胞以来，逐渐被应用于同种异体组织工程动物模型研究中。与骨髓、骨膜、肌肉、脂肪等来源的间充质干细胞比较，滑膜间充质干细胞具有更强的增殖能力与成软骨分化能力^[12-13]。滑膜间充质干细胞可分化为软骨细胞、骨细胞及脂肪细胞等^[14-19]，可作为软骨损伤、骨损伤及韧带损伤等组织工程中的种子细胞。尽管研究已显示滑膜间充质干细胞可分化为成骨细胞，但将其应用于骨组织工程的研究并不多。

有研究发现，过表达降钙素基因相关肽的转基因小鼠骨密度明显增加，而低表达降钙素基因相关肽的转基因小鼠骨量明显减少^[20]，提示降钙素基因相关肽可能参与了骨代谢过程。降钙素基因相关肽是感觉神经末梢释放的神经肽类物质，广泛分布于心血管、消化系统、呼吸系统、泌尿生殖系统、皮肤及运动系统等组织器官中，在机体许多生理与病理过程中发挥作用^[21-24]。近年王浩等^[25]研究发现降钙素基因相关肽可促进滑膜间充质干细胞的增殖与成骨分化。但目前对于降钙素基因相关肽促进滑膜间充质干细胞增殖与成骨分化的机制尚不清晰。

实验探讨Wnt/β-catenin信号通路在降钙素基因相关肽促进滑膜间充质干细胞增殖与成骨分化中的作用，进一步明确降钙素基因相关肽在骨代谢过程中的具体作用途径。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年3至12月在海南省第三人民医院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 1月龄新西兰大白兔，雌雄不限，体质量2.1-3.0 kg，实验过程中对动物的处置遵循动物伦理学标准进行。

1.3.2 实验试剂 降钙素基因相关肽(徐州微科曼得生物工程有限公司)；DMEM/F12培养基(SIGMA-ALDRICH中国)；FITC标记的鼠抗人CD68抗体、FITC标记的鼠抗人CD90抗体(北京博奥龙免疫技术有限公司)；PE标记的鼠抗人CD105抗体(厦门研科生物技术有限公司)；0.25%胰蛋白酶(上海千曦生物科技有限公司)；Ⅰ型胶原酶(上海翊圣生物科技有限公司)；Wnt信号通路抑制剂DKK-1(美国StemRD公司)；兔抗大鼠β-catenin抗体、兔抗大鼠GAPDH抗体(北京百奥莱博科技有限公司)；成骨诱导分化培养基(赛业生物科技有限公司)；CCK-8细胞增殖检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；BCA蛋白定量检测试剂盒、蛋白提取试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)；RT-PCR检测试剂盒(广州健仑生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 滑膜间充质干细胞的分离培养 麻醉下处死新西兰大白兔，无菌条件下分离双侧膝关节处滑膜组织，将滑膜组织修剪成将1-3 mm³大小的小碎块，以PBS冲洗3次，置入含有0.25%胰蛋白酶的小烧杯中，磁力搅拌，置于37 ℃含体积分数5%CO₂恒温培养箱中消化30 min，添加培养基终止消化，100目过滤网过滤，再以PBS清洗3次，然后将滑膜碎块置入含0.2%Ⅰ型胶原酶的烧杯中，磁力搅拌，置于37 ℃恒温培养箱中消化2 h，添加DMEM/F12培养基终止消化，100目过滤网过滤，获取滤液，2 000 r/min离心8 min，去掉上清，添加DMEM/F12培养基悬浮细胞。将细胞以2×10⁹ L^-1细胞浓度接种于培养瓶中，置于37 ℃含体积分数5%CO₂恒温培养箱中，两三天换液1次，当培养瓶中细胞融合至80%以上时，可将细胞消化传代培养^[26]。

1.4.2 滑膜间充质干细胞的鉴定 取第3代滑膜间充质干细胞，调整细胞浓度为1×10⁸ L^-1，分装于EP管内，分别加入FITC标记的鼠抗人CD68抗体、FITC标记的鼠抗人CD90抗体、PE标记的鼠抗人CD105抗体，4 ℃避光孵育30 min，流式细胞仪进行检测。

1.4.3 降钙素基因相关肽干预滑膜间充质干细胞 选择第3代滑膜间充质干细胞，加入DMEM/F12培养基，调整细胞浓度为2×10⁹ L^-1，接种于96孔板中培养，每孔100 μL，分4组干预：①常规培养、不进行任何干预，记为空白对照组；②加入10^-8 mol/L的降钙素基因相关肽，记为实验组；③加入10^-8 mol/L的Wnt信号通路抑制剂DKK-1，记为抑制剂组；④加入10^-8 mol/L的Wnt信号通路抑制剂DKK-1与10^-8 mol/L的降钙素基因相关肽，记为联合干预组；每组设6个复孔，置于37 ℃含体积分数5%CO₂细胞培养箱中培养，两三天换液1次。

1.4.4 Western blotting检测β-catenin蛋白表达 按上述分组干预细胞14 d后，加入0.3 mL含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂，抽提总蛋白，进行Western blotting检测，简要流程如下：采用BCA蛋白质定量试剂盒测定样品浓度，将蛋白样品加入电泳上样缓冲液，煮沸变性后于10% SDS-PAGE电泳分离蛋白质，转膜后加入5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗(兔抗大鼠β-catenin抗体、兔抗大鼠GAPDH抗体)4 ℃孵育过夜，用TBST洗膜3次，加入二抗室温孵育1 h，TBST洗膜3次，加入发光液显色后于凝胶成像系统拍照，采用ImageJ分析软件拍摄条带，分析样品目的蛋白相对含量，即目的蛋白的灰度值与内参GAPDH灰度值比值。

1.4.5 CCK-8法检测细胞增殖 按上述分组干预细胞，于培养的第0，3，5，7，9天，在每孔内加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃避光孵育2 h，将96孔板放入酶标仪中，以培养基调零，在450 nm处检测吸光度值，绘制细胞生长曲线。

1.4.6 细胞成骨诱导分化实验 选择第3代滑膜间充质干细胞，加入DMEM/F12培养基，调整细胞浓度为2×10⁹ L^-1，接种于96孔板中培养，每孔100 μL，分4组干预：①加入成骨诱导培养基(含10^-7 mol/L地塞米松，10 mmol/L β-磷酸甘油，0.5 mmol/L 2-磷酸-L-抗坏血酸，体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养液)，记为空白对照组；②加入成骨诱导培养基与10^-8 mol/L的降钙素基因相关肽，记为实验组；③加入成骨诱导培养基与10^-8 mol/L的Wnt信号通路抑制剂DKK-1，记为抑制剂组；④加入成骨诱导培养基、10^-8 mol/L的Wnt信号通路抑制剂DKK-1与10^-8 mol/L的降钙素基因相关肽，记为联合干预组，每组设6个复孔，两三天换液1次。

1.4.7 茜素红染色 按上述分组干预14 d，取各组细胞，弃掉成骨诱导培养基，以冷PBS清洗3次；弃PBS，每孔添加40 g/L多聚甲醛固定30 min；弃多聚甲醛，再次以冷PBS清洗3次；弃PBS，每孔添加茜素红染色液，染色5 min；弃茜素红染色液，以冷PBS清洗3次；光学显微镜下观察染色情况，采用ImageJ软件分析染色面积，观察矿化结节生成情况。

1.4.8 碱性磷酸酶活性检测 按上述分组干预14 d，取各组细胞，弃掉成骨诱导培养基，以冷PBS清洗3次；每孔添加100 μL RIPA溶液，置于冰上孵育30 min；1 200×g离心20 min，吸取上清液，按照碱性磷酸酶检测试剂盒说明书操作，将100 μL工作液与20 μL上清液混合均匀，37 ℃避光孵育15 min，加入终止液，采用酶标仪检测405 nm处的吸光度值，与标准曲线对比获得碱性磷酸酶活性值。

1.4.9 RT-PCR检测成骨相关基因表达 按上述分组干预14 d，取各组细胞，提取总RNA，根据反转录试剂盒说明书操作，反转录得到cDNA，选择反转录产物，进行实时荧光定量RT-PCR检测，设计的PCR引物序列为：①碱性磷酸酶：上游引物，5'-CGT TGA CTG TGG TTA CTG CTG A-3'；下游引物，5'-TTG TAA CCA GGC CCG TTG-3'；②骨形态发生蛋白2：上游引物，5'-CGT GCT CAG CTT CCA TCA C-3'；下游引物，5'-CCT GCA TTT GTT CCC GAA A-3'；③Ⅰ型胶原：上游引物，5'-TCT CCA TGG CCT CTG CAA-3'；下游引物，5'-CAT GTG TGG CCG ATG TTT C-3'；④Runx2：上游引物，5'-TTT GCA GTG GGA CCG ACA-3'；下游引物；5'-AGC CAT GGT GCC CGT TAG-3'；⑤GAPDH：上游引物，5'-CAC AGT CAA GGC TGA GAA TG-3'；下游引物，5'-GGT GGT GAA GAC GCC AGT A-3'。待反应结束后，在PCR仪上获取Ct值，通过计算机软件得出基因的相对表达量。

1.5 主要观察指标 经不同方法干预后，各组滑膜间充质干细胞的增殖、成骨分化能力及成骨分化相关基因的表达。

1.6 统计学分析 实验采用SPSS 21.0统计学软件进行统计学处理，实验中的数据均以x(_)±s表示，组间比较进行One-way ANOVA与Student’s t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

Wnt信号通路是一个拥有已知至少19个家族成员的分泌型糖蛋白家族，分经典通路与非经典通路两种，广泛存在于生物体内，具有高度进化保守性，参与调控细胞的增殖、分化、凋亡及迁移等^[27-28]。Wnt/β-catenin信号通路属于经典Wnt信号通路。以往研究已证实，Wnt/β-catenin信号通路在骨形成、重建及修复等过程中发挥着重要作用^[29-30]。在降钙素基因相关肽促进滑膜间充质干细胞增殖与成骨分化的过程中，Wnt/β-catenin信号通路发挥了怎样的作用？基于此，此次研究以滑膜间充质干细胞为观察对象，观察降钙素基因相关肽对其增殖与成骨分化的作用，以及此过程与Wnt/β-catenin信号通路的关系。

实验将滑膜间充质干细胞分4组干预，干预细胞14 d后进行Western blotting检测，发现实验组β-catenin蛋白表达明显高于空白对照组，说明降钙素基因相关肽可促进滑膜间充质干细胞中β-catenin蛋白的表达；抑制剂组β-catenin蛋白表达明显低于空白对照组，说明Wnt信号通路抑制剂DKK-1抑制了滑膜间充质干细胞中β-catenin蛋白的表达；联合干预组β-catenin蛋白表达较抑制剂组明显升高，再一次说明降钙素基因相关肽可促进β-catenin蛋白的表达。

细胞增殖检测结果显示，伴随着β-catenin蛋白的高表达，实验组培养的不同时间点细胞增殖始终快于其余3组；培养的第5-9天，抑制剂组细胞增殖慢于空白对照组，联合干预组细胞增殖快于抑制剂组，此部分结果说明降钙素基因相关肽可促进滑膜间充质干细胞的增殖，而Wnt信号通路抑制剂DKK-1可明显减弱其促进作用。此结果也间接提示Wnt/β-catenin信号通路的激活在降钙素基因相关肽促进滑膜间充质干细胞的增殖中发挥了重要作用。

为观察Wnt/β-catenin信号通路在降钙素基因相关肽促进滑膜间充质干细胞成骨分化中的作用，进行了茜素红染色、碱性磷酸酶活性以及成骨相关基因碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runx2及Ⅰ型胶原基因表达的检测。研究结果显示经降钙素基因相关肽干预滑膜间充质干细胞14 d后，伴随着β-catenin蛋白表达的升高，实验组成骨诱导分化14 d的矿化结节形成数量与面积，碱性磷酸酶活性，成骨相关基因碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runx2及Ⅰ型胶原基因表达较空白对照组均明显升高，表明降钙素基因相关肽促进了滑膜间充质干细胞的成骨分化；而采用Wnt信号通路抑制剂DKK-1干预滑膜间充质干细胞14 d后，伴随着β-catenin蛋白表达的降低，抑制剂组成骨诱导分化14 d的矿化结节形成数量与面积，碱性磷酸酶活性，成骨相关基因碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runx2及Ⅰ型胶原基因表达较空白对照组均明显降低，说明Wnt/β-catenin信号通路参与了滑膜间充质干细胞的成骨分化过程；经降钙素基因相关肽与Wnt信号通路抑制剂DKK-1联合干预后，滑膜间充质干细胞成骨诱导分化14 d的矿化结节形成数量与面积，碱性磷酸酶活性，成骨相关基因碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runx2及Ⅰ型胶原基因表达均较抑制剂组明显提升，综合此部分结果提示降钙素基因相关肽的确可促进滑膜间充质干细胞的成骨分化，此过程可能部分通过激活Wnt/β-catenin信号通路上调成骨相关基因碱性磷酸酶、骨形态发生蛋白2、Runx2及Ⅰ型胶原基因表达来实现的。

综上所述，降钙素基因相关肽能促进滑膜间充质干细胞的增殖与成骨分化，且Wnt/β-catenin信号通路与其增殖与成骨分化调控密切相关。此次研究只是采用了经典信号通路抑制剂，在降钙素基因相关肽促进滑膜间充质干细胞增殖与成骨分化的过程中是否还涉及非经典Wnt通路及其与经典通路的关系还需要更大量更深入的研究。

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