Purmorphamine对神经干细胞分化的影响及其机制

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0626

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (29): 4675-4680.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0626

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

Purmorphamine对神经干细胞分化的影响及其机制

黄志，张良明，陈瑞强，杨阳，杨补，刘畅，陈振翔，刘灿，戎利民，刘斌

中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630

修回日期:2018-07-31 出版日期:2018-10-18 发布日期:2018-10-18
通讯作者: 刘斌，博士，主任医师，博士生导师，中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630；戎利民，中山大学附属第三医院脊柱外科，广东省广州市 510630
作者简介:黄志，男，1990年生，2018年中山大学毕业，硕士，主要从事脊髓损伤研究。
基金资助:
国家自然科学基金面上项目(81772349，31470949)；广东省自然科学基金(2017A030313594)；广州市科技计划项目(201707010115)

Effect of purmorphamine on neural stem cell differentiation and its mechanism

Huang Zhi, Zhang Liang-ming, Chen Rui-qiang, Yang Yang, Yang Bu, Liu Chang, Chen Zhen-xiang, Liu Can, Rong Li-min, Liu Bin

Department of Spinal Surgery, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China

Revised:2018-07-31 Online:2018-10-18 Published:2018-10-18
Contact: Liu Bin, MD, Chief physician, Doctoral supervisor, Department of Spinal Surgery, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China； Rong Li-min, Department of Spinal Surgery, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
About author:Huang Zhi, Master, Department of Spinal Surgery, Third Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510630, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81772349, 31470949; the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2017A030313594; the Scientific Research Plan of Guangzhou, No. 201707010115

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
神经干细胞：是指一群能够多向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多能干细胞。神经干细胞在体外能被特定因子诱导分化为不同类型的神经细胞，为中枢及外周神经损伤修复及治疗提供了新的途径。由于其具有良好的增殖分化潜能，经常用作脊髓损伤组织工程的种子细胞。
Shh信号通路：在哺乳动物胚胎发育和器官形成过程中具有重要的调控作用，包括神经管定向分化、细胞表型分化及肢体生长发育等。而异常的Shh信号通路可导致多种起源内胚层的组织发生癌变，如乳腺癌、肺癌、肝癌和前列腺癌等众多肿瘤的生长。

摘要
背景：神经干细胞的增殖及分化一直是研究的难点和热点，有效提高神经干细胞向神经细胞的分化效率具有重要的意义。据最近文献报道，小分子化合物purmorphamine在各类细胞增殖及分化实验中的应用越来越广泛。
目的：探讨小分子化合物purmorphamine通过上调Shh信号通路对神经干细胞分化为各类神经细胞的促进作用。
方法：从小鼠胚胎海马区分离培养得到原代神经干细胞，取第2-4代生长良好的细胞分为对照组及实验组。对照组用不添加purmorphamine的分化培养基培养，实验组用添加1 μmol/L purmorphamine的分化培养基培养。培养7，14 d后，通过免疫细胞化学、RT-qPCR方法检测神经细胞标志物的表达量。
结果与结论：①体外培养的神经干细胞生长良好，神经球中的大部分细胞表达特异性标志物nestin；②对照组及实验组均可见到TUJ1、GFAP、MAP2、MBP染色阳性；③RT-qPCR显示第7天实验组的TUJ1、GFAP、MAP2、MBP表达量均比对照组显著增高(P < 0.05)；第14天实验组的Smo、Ptc1、Gli-1表达量比对照组显著增高(P < 0.05)；GFAP、MAP2、MBP的表达量也比对照组显著增高(P < 0.05)；④以上数据表明purmorphmine能通过上调Shh信号通路来促进神经干细胞的分化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0001-6305-1102(黄志)

关键词: 神经干细胞, Purmorphamine, 分化, Shh信号通路, 干细胞, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: The proliferation and differentiation of neural stem cells have always been a difficulty and a hot topic, which is of great significance to effectively increase the differentiation efficiency of neural stem cells into nerve cells. Recent reports have shown that purmorphamine, a small molecule compound, is widely used in various cell proliferation and differentiation experiments.
OBJECTIVE: To investigate the role of purmorphamine in promoting the differentiation of neural stem cells into various types of nerve cells by up-regulating the Sonic Hedgehog(Shh) signaling pathway.
METHODS: Primary neural stem cells were isolated from the hippocampus of mouse embryonic hippocampus. Cells at passages 2-4 were cultured in differentiation medium with purmorphamine (1 μmol/L; experimental group) or without purmorphamine (control group) for 7 and 14 days. The differentiation of neural stem cells was detected by immunocytochemistry and RT-qPCR.
RESULTS AND CONCLUSION: Neural stem cells grew well in vitro, and most of the cells in the neurospheres expressed a specific marker of nestin. The cells cultured in the two groups were positive for TUJ1, GFAP, MAP2 and MBP. RT-qPCR results showed that the expression of TUJ1, GFAP, MAP2 and MBP in the experimental group was significantly higher than that in the control group at 7 days of culture (P < 0.05). The expression of Smo, Ptc1 and Gli-1 in the experimental group was significantly higher than that in the control group and the expression of GFAP, MAP2 and MBP was also significantly increased at 14 days of culture (P < 0.05). To conclude, purmorphmine can promote the differentiation of neural stem cells by up-regulating the Shh signaling pathway.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Key words: Neural Stem Cells, Cell Differentiation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

黄志，张良明，陈瑞强，杨阳，杨补，刘畅，陈振翔，刘灿，戎利民，刘斌. Purmorphamine对神经干细胞分化的影响及其机制[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(29): 4675-4680.

Huang Zhi, Zhang Liang-ming, Chen Rui-qiang, Yang Yang, Yang Bu, Liu Chang, Chen Zhen-xiang, Liu Can,Rong Li-min, Liu Bin. Effect of purmorphamine on neural stem cell differentiation and its mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(29): 4675-4680.

图/表（结果） 1

2.1 神经干细胞的培养、分化及鉴定结果 原代神经干细胞增殖迅速，聚集呈球形或不规则形状。传代后，杂质细胞减少，神经球呈规则圆形，折光性强，内部结构清晰。用第3代神经干细胞标志物巢蛋白Nestin进行染色，结果显示神经球内大多数细胞呈Nestin染色阳性(图1)。

使用去除表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子的Neural basal培养基，将生长良好的神经球贴壁培养，第2天便能看见神经球边缘有细胞密集爬出(图2A，D)，实验组神经球周围爬出的细胞数量更多更密集；第7天镜下可见神经球周围长出密密麻麻的神经细胞，并可见明显的胞体及突起(图2B，E)，实验组神经细胞生长更加良好，数量更多；第14天神经细胞数量增多，突起交织呈网络状(图2C，F)，实验组中神经细胞数量更多，交联更加紧密。

2.2 免疫荧光检测神经细胞标志物的表达 对照组及实验组分别用未成熟神经元细胞标志物TUJ1、星形胶质细胞标志物GFAP、成熟神经元标志物MAP2、少突胶质细胞标志物MBP进行染色，均呈阳性，证明了神经干细胞向星形胶质细胞、少突胶质细胞及神经元分化(图3，4)。

从显微镜下的荧光强度来看，第7天时实验组的TUJ1、GFAP、MAP2、MBP阳性细胞数量及神经突起均比对照组多，说明了添加purmorphamine分化培养7 d后，分化细胞中的TUJ1、GFAP、MAP2、MBP表达量较对照组明显提高；第14天时实验组的GFAP、MAP2、MBP阳性细胞数量及神经突起均比对照组多，说明了添加purmorphamine分化培养14 d后，分化细胞中的GFAP、MAP2、MBP表达量较对照组明显提高。因为TUJ1为幼稚神经元标记物，在第14天时表达量显著降低，故两组没有明显差异。通过人工结合软件计数，可知第7天对照组中TUJ1、GFAP、MAP2、MBP阳性细胞率分别为27.59%，19.00%，12.23%，5.78%；实验组的阳性细胞率分别为41.36%，23.41%，17.65%，8.82%。第14天对照组中TUJ1、GFAP、MAP2、MBP阳性细胞率分别为11.52%，18.73%，7.35%，6.52%；实验组的阳性细胞率分别为10.37%，25.17%，35.53%，10.46%。

2.3 RT-qPCR检测Shh信号通路及分化标志物表达 无论是第7天还是第14天，实验组的SMO、PTCH1、GLI1表达量均比对照组显著增高(P < 0.05)，表明purmorphamine有效激活了Shh信号通路。在神经细胞分化标志物表达上，第7天时实验组的TUJ1、GFAP、MAP2、MBP表达量均比对照组显著增高(P < 0.05)，证明purmorphmine能有效促进神经干细胞向各类神经细胞分化。第14天时实验组的GFAP、MAP2、MBP表达量也显著增高；TUJ1表达量差异无显著性意义，因为TUJ1是神经元早期表达的标记物，在第14天时表达量显著减少。以上数据表明了purmorphmine能有效上调Shh信号通路表达及促进神经干细胞的分化(图5)。

参考文献

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引言

神经干细胞是指一群能够多向分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多能干细胞。神经干细胞在体外能被特定因子诱导分化为不同类型的神经细胞，为中枢神经及外周神经损伤修复及治疗提供了新的途径^[1-2]。神经干细胞的发育与分化受到多个信号通路的调节，如Notch信号通路^[3-4]、Wnt信号通路^[5]、Shh信号通路等。这些信号通路互相促进或拮抗，共同调节神经干细胞的生长分化。

Sonic Hedgehog(Shh)信号通路是哺乳动物胚胎发育过程中调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路^[6]。Shh信号通路是1980年在果蝇基因上发现的，该基因突变后导致果蝇皮肤外表出现连续的刺状突起，故被命名为Hedgehog(Hh)基因^[7]。Shh信号通路由分泌性糖蛋白Shh、2个跨膜蛋白受体Ptch和Smo、转录因子Gli蛋白家族及下游基因构成^[8]。当Shh与Ptch结合时，Smo上的抑制效应被解除，通过第二信使将下游的Gli蛋白激活，Gli能启动多种目的基因的表达^[9]。Shh信号通路在胚胎发育特别是神经系统发育中发挥着重要作用。在发育的早期，神经管腹侧的脊索和底板分泌Shh，诱导腹侧产生不同类型的神经元前体细胞，同时又诱导背侧细胞分化为运动神经元^[10]。敲除Shh基因大鼠的海马区和脑室下区神经前体细胞显著减少，表现为发育畸形；激活成年大鼠的Shh信号通路可使海马区和脑室下区神经前体细胞增殖^[11]。

近年来，一种名为purmorphamine(PM)的2，6，9-三取代嘌呤化合物，被用作Shh的替代物应用于调节Shh信号通路的实验研究中。Purmorphamine能够替代Shh与信号通路中的Smo结合，从而激活Shh信号通路。与Shh相比，purmorphamine的优点在于效果更稳定及容易获取^[12]。Purmorphamine作为成骨诱导剂被应用于多能间充质细胞或C3H/10T1/2细胞诱导骨生成^[13-14]；还可以用作小鼠胚胎干细胞诱导成类胚体的培养基成分，能有效促进小鼠胚胎干细胞的神经分化^[15]。Purmorphamine作为新型的Shh信号通路激动剂，对依赖Shh信号通路调节的神经干细胞分化具有潜在的重要意义。为了研究purmorphamine在神经干细胞分化过程中的作用，使用purmorphamine进行神经干细胞的体外分化实验，观察其分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的效率，验证Shh信号通路在其中所起的作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年5月至2017年8月在中山大学附属第三医院中心实验室完成。

1.3 材料 DMEM/F12培养基、Neuralbasal培养基、Accutase消化液、B27无血清培养添加剂、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、Purmorphamine、左旋多聚赖氨酸(Sigma公司)；L-谷氨酰胺、兔抗小鼠Nestin单克隆抗体(Abcam公司)；小鼠抗BrdU单克隆抗体(Sigma公司)；兔抗小鼠GFAP单克隆抗体(Santa Cruz公司)；羊抗小鼠βⅢ-tubulin单克隆抗体(Millipore公司)；羊抗小鼠MBP单克隆抗体(Santa Cruz公司)；兔抗小鼠MAP-2单克隆抗体(Millipore公司)；荧光二抗、hoechst 33342(Sigma公司)；E.Z.N.A.^®DNA/RNAIsolation Kit(Bio-tek公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 神经干细胞培养 孕12.5 d的昆明小鼠1只(中山大学动物实验中心提供)，放于二氧化碳箱窒息处死，在超净台上用无菌器械取出胚胎，放于PBS平衡液中分离端脑皮质及海马，充分剪碎后用巴氏管反复轻柔吹打50次，再用200目滤网过滤除去较大的组织块和细胞团，1 000 r/min离心5 min，去掉上清液，加入神经干细胞培养液(DMEM/F12培养液添加2%B27、50 μL L-谷氨酰胺、20 μg/L表皮生长因子和20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子)。根据细胞计数，将细胞悬液浓度调整为1×10⁹ L^-1，置于CO₂培养箱内培养，待神经球生长到第5天，进行1∶3传代。待第2代细胞形成神经球后，进行鉴定及后期实验。

1.4.2 神经细胞分化培养 在6孔板中添加0.1 g/L多聚赖氨酸铺板过夜，第2天吸去多聚赖氨酸晾干2 h。取第2代或第3代大小适合的神经球，离心(700 r/min)，置于6孔板中，添加少量分化培养基(Neuralbasal培养基添加2%B27、50 μL L-谷氨酰胺、1 μmol/L purmorphamine^[16])，每3 d半量换液。以不添加purmorphamine为对照组。

1.4.3 免疫荧光染色 上述对照组及实验组细胞培养7，14 d后进行免疫荧光染色。用PBS清洗细胞3次，加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，每次5 min；加入6%牛血清白蛋白及0.2%triton x-100混合液封闭1 h，PBS洗3次，每次5 min；加入下列一抗：小鼠抗GFAP单克隆抗体(1∶400)、小鼠抗βⅢ-tubulin单克隆抗体(1∶1 000)、小鼠抗MBP单克隆抗体(1∶800)、小鼠抗MAP-2单克隆抗体(1∶2 000)，4 ℃过夜，PBS洗3次，每次5 min；加入荧光二抗室温避光孵育1 h，hoechst 33342复染，PBS洗3次，每次5 min；荧光显微镜下，每孔取上、下、左、右、中5个视野，即每组每种显色共20个视野进行计数。

1.4.4 RT-qPCR检测 上述对照组及实验组细胞培养7，14 d后进行RT-qPCR检测。用PBS清洗细胞1次，每孔加入350 μL裂解液处理5 min；充分吹打细胞裂解液，转移至匀浆柱中离心(10 000×g，1 min)，收集流出液并加入350 μL无水乙醇，转移到Hibind RNA Mini column中离心(10 000×g，3 min)，弃掉流出液；每管加入RNA wash buffer Ⅰ 300 μL离心(10 000×g，1 min)，弃掉流出液；继续用RNA wash buffer Ⅱ清洗离心柱2次，晾干5 min；最后加入DEPC水洗脱离心柱(13 000×g，1 min)；测试提取的RNA样品浓度，并用RT Master Mix反转录为cDNA；将cDNA配制成20 μL体系进行RT-qPCR检测。以GAPDH为内参对照，各PCR引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 神经干细胞分化培养7，14 d时神经细胞标记物的表达量。

1.6 统计学分析 研究结果数据用SPSS 20.0统计软件分析处理，用Graph Pad Prim5进行图表制作，用Image-Pro Plus6.0进行荧光图片的合成及阳性率的计算。数据均采用x(_)±s表示，两组间比较采用t 检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

脊髓损伤的修复和治疗是目前的热点和难点。近年来，通过向受损部位植入外源性干细胞治疗脊髓损伤显示了良好的应用前景。神经干细胞具有自我更新和多向分化能力，是优良的脊髓损伤修复种子细胞^[17-18]。有研究表明，神经干细胞虽能促进脊髓区空洞的修复，但绝大部分分化为星形胶质细胞，形成的瘢痕组织阻碍了神经通路的重建^[19]。因此，提高神经干细胞向神经元、少突胶质细胞的分化是解决神经干细胞治疗脊髓损伤的关键。

人类中枢神经系统发育和分化是一个涉及多个信号系统的复杂网络系统，可以分为全能干细胞、神经前体细胞、神经干细胞、神经元及胶质细胞等阶段。目前已知的涉及调控神经干细胞增殖或分化的信号通路有Notch信号通路^[3-4]、Wnt信号通路^[5]、Shh信号通路等，这些信号通路之间存在串话关系^[20]，既互相促进又互相制约，共同决定着神经干细胞的命运。

Shh信号通路与神经形成息息相关。有研究表明，Shh信号通路除了促进胚胎发育过程中神经前体细胞的增殖和分化外^[21]，还在轴突的生长中起到了导向的作用^[22]。在体外细胞实验中，激活的Shh信号通路能够促使间充质干细胞分化为神经细胞^[23]；同时还能促进人胚胎干细胞及小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化。由于提高神经干细胞向神经元分化具有重大的意义，因此，该课题研究purmorphamine通过Shh信号通路促进神经干细胞分化的作用。

许多研究表明，维甲酸能促进胚胎干细胞、骨髓基质干细胞及神经干细胞等多种干细胞向神经元分化，广泛应用于各种分化培养基中^[16^，^24]。目前维甲酸的神经分化作用机制尚不完全明确。有研究表明维甲酸通过上调Pax6、Pax7及En1基因的表达，使细胞的表型和分化方向发生转变^[25]。该课题为了排除维甲酸对实验结果的影响，单独研究了purmorphamine的分化作用及其依赖的信号通路。从免疫荧光结果来看，第7天实验组的未成熟神经干细胞阳性率显著多于对照组，第14天实验组的成熟神经元显著多于对照组；同时，实验组的星形胶质细胞阳性率也比对照组高。RT-qPCR结果显示，实验组的GFAP、MAP2、MBP相对表达量均比对照组显著性增高，与免疫荧光结果相符。以上结果表明，purmorphamine能够上调SMO、PTCH及GLI的表达，这些上游因子的上调证明能有效激活Shh信号通路，并且促进神经干细胞向各个分支分化。

在脊髓损伤的组织工程学研究中，神经干细胞向神经元的分化具有重要的意义。一般情况下，体外培养的神经干细胞分化效率并不高；复合于组织工程支架植入体内的神经干细胞分化效率更低^[26]。许多研究运用新型组织工程支架或者复合细胞生长因子的办法提高神经干细胞的自我更新及分化能力^[27-28]。该研究通过细胞实验证明了purmorphamine能提高神经干细胞的分化效率，对于神经干细胞的体外培养具有重要意义。未来仍需进一步研究如何降低向星形胶质细胞分化及purmorphamine在体内实验的应用。

综上所述，purmorphamine能拓宽神经干细胞在治疗脊髓损伤中的临床应用，为干细胞治疗提供新的思路和方法。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Purmorphamine对神经干细胞分化的影响及其机制

Effect of purmorphamine on neural stem cell differentiation and its mechanism

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