骨髓间充质干细胞局部移植联合雌二醇肌注治疗脊髓损伤

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0410

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (1): 53-58.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0410

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骨髓间充质干细胞局部移植联合雌二醇肌注治疗脊髓损伤

卜志勇¹，胡良蛟¹，李晨¹，李安军²

¹湖北医药学院附属人民医院白浪院区(骨科中心)，湖北省十堰市 442000；²湖北医药学院附属人民医院/十堰市人民医院脊柱外科，湖北省十堰市 442000

修回日期:2017-08-07 出版日期:2018-01-08 发布日期:2018-01-08
通讯作者: 李安军，硕士，副主任医师，湖北医药学院附属人民医院/十堰市人民医院脊柱外科，湖北省十堰市 442000
作者简介:卜志勇，男，1976年生，湖北省竹溪县人，2011年湖北中医药大学毕业，硕士，副教授，副主任医师，主要从事脊柱脊髓疾病的诊断与治疗。
基金资助:
2015年度湖北省教育厅科学研究计划指导性项目(B2015176)

Intramuscular injection of estradiol combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for spinal cord injury

Bu Zhi-yong¹, Hu Liang-jiao¹, Li Chen¹, Li An-jun²

¹Bailang Branch, Affiliated People’s Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei Province, China; ²Department of Spinal Surgery, Affiliated People’s Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei Province, China

Revised:2017-08-07 Online:2018-01-08 Published:2018-01-08
Contact: Li An-jun, Master, Associate chief physician, Department of Spinal Surgery, Affiliated People’s Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei Province, China
About author:Bu Zhi-yong, Master, Associate professor, Associate chief physician, Bailang Branch, Affiliated People’s Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, Hubei Province, China
Supported by:
the Scientific Research Program Guidance Project of Hubei Provincial Department of Education in 2015, No. B2015176

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
超氧化物歧化酶：是一种源于生命体的活性物质，能清除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。作为一种新型酶制剂，它在生物体内分布极广。它可对抗和阻断因氧自由基对细胞造成的损伤，并及时修复受损细胞。通过催化反应将有害的超氧化物质转化为过氧化氢。超氧化物歧化酶水平升高提示机体抗氧化能力增强。
丙二醛：在生物体内，自由基作用于脂质发生过氧化反应，氧化终产物即为丙二醛，会引起蛋白质、核酸等生物大分子的交联聚合，且具有一定的细胞毒性，在体外可影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性。丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤，因此，可通过丙二醛了解膜脂过氧化的程度。丙二醛水平降低提示机体氧化应激程度减轻，抗氧化能力增强。
细胞凋亡：是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的现象，而是为了更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
氧化应激反应：机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物，从而导致组织损伤。氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。

摘要
背景：雌激素在预防脊髓继发性损伤、保护神经功能方面具有重要作用，并且雌激素在体外能抑制骨髓间充质干细胞凋亡，但是将雌激素与骨髓间充质干细胞联合应用于治疗脊髓损伤尚未见相关报道。
目的：探讨雌二醇肌注联合骨髓间充质干细胞局部移植治疗脊髓损伤的效果与机制。
方法：SD大鼠144只随机分为联合组、骨髓间充质干细胞组、雌二醇组和对照组。建立脊髓损伤模型后，分别于损伤中心移植6×10⁶个(60 μL)骨髓间充质干细胞或无菌PBS，肌注雌二醇250 μg/kg或生理盐水，移植后进行相关指标检测。
结果与结论：①造模后1，4周，联合组的行为学评分都明显高于其他3组(P < 0.05)；②移植后3，7 d联合组的超氧化物歧化酶水平明显高于其他3组，而丙二醛水平明显低于其他3组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③移植后3，7 d联合组的损伤脊髓细胞凋亡率明显低于其他3组(P < 0.05)；④结果表明，雌二醇能减轻脊髓损伤的继发性细胞凋亡，抑制氧化应激反应，有助于骨髓间充质干细胞移植后损伤脊髓运动功能的恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
ORCID: 0000-0003-2710-921X(卜志勇)

关键词: 干细胞, 脊髓损伤, 雌二醇, 骨髓间充质干细胞, 细胞凋亡, 氧化应激反应

Abstract:

BACKGROUND: Even though estrogen can prevent secondary spinal cord injury, exert a neuroprotective role, and inhibit apoptosis in mesenchymal stem cells in vitro, little is reported on the combined use of estrogen and bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in the treatment of spinal cord injury.
OBJECTIVE: To investigate the effects and mechanism of s intramuscular injection of estradiol combined with BMSCs in the treatment of spinal cord injury.
METHODS: One hundred and forty-four Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: combined group, BMSCs group, estradiol group and control group. After the establishment of spinal cord injury model, the rats were given intramuscular injection of estradiol 250 µg/kg estradiol combined with 6×10⁶ BMSCs (60 μL), BMSCs, estradiol or PBS in different groups, respectively. After transplantation, related indicators were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: At 1 and 4 weeks after modeling, the behavioral scores in the combined group were significantly higher than those in the other three groups (P < 0.05). At 3 and 7 days after transplantation, superoxide dismutase levels in the combined group were significantly higher than those in the other three groups, but the malondialdehyde levels were lowest in the combined group (P < 0.05). At 3 and 7 days after transplantation, the apoptotic rate in the spinal cord tissues was significantly lower in the combined group than the other three groups (P < 0.05). To conclude, estradiol can alleviate secondary cell apoptosis and inhibit oxidative stress after spinal cord injury, which contributes to the spinal motor function recovery after BMSCs transplantation.

Key words: Spinal Cord Injuries, Estradiol, Bone Marrow, Mesenchymal Stem Cell Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R394.2

卜志勇，胡良蛟，李晨，李安军. 骨髓间充质干细胞局部移植联合雌二醇肌注治疗脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(1): 53-58.

Bu Zhi-yong, Hu Liang-jiao, Li Chen, Li An-jun. Intramuscular injection of estradiol combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for spinal cord injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(1): 53-58.

图/表（结果） 1

参考文献

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引言

材料方法

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2016年1至12月在湖北医药学院附属人民医院中心实验室与动物实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 SD大鼠150只，三四周龄，雌雄不限，体质量250-350 g，由湖北医药学院实验动物中心提供(实验动物批号为208114)；饲养室温度23 ℃左右，定时杀菌、消毒，相对湿度为65%左右。

1.3.2 实验用试剂和仪器 携带GFP基因的复制缺陷性病毒包装细胞(美国Promega公司)；RBITC标记的山羊抗兔IgG(H+L)二抗(美国Promega公司)；Cy5标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗(美国Promega公司)；超氧化物歧化酶和丙二醛测定试剂盒(美国Gibco公司)；TUNEL试剂盒(美国Gibco公司)。全套动物解剖器械(中国苏净集团)；恒冷切片机(美国Sheldon公司)；2K-380型低温离心机(日本日立公司)；彩色多媒体病理图象处理系统(日本日立公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨髓间充质干细胞培养和GFP标记 无菌环境下剥离6只SD大鼠肌肉和股骨骨膜，冲洗骨髓腔，1 000 r/min离心10 min，沉淀加入15 mL DMEM培养液重悬细胞。将细胞浓度调整至1×10¹⁰ L^-¹，放置于含有Ficoll淋巴分离液的离心管中，2 000 r/min离心30 min。吸出培养基和分离液之间的细胞层，再用DMEM培养基洗涤3次，将细胞浓度调整至1×10⁹ L^-1，置于CO₂培养箱进行培养与传代。GFP标记方法：取病毒储存液在HEK293细胞中反复扩增，收集培养上清液和细胞，反复冻溶破坏细胞，离心取上清液，过滤除去细菌，以氯化铯密度梯度离心法进行纯化，空斑实验法测定转染液病毒滴度为2×10¹³ pfu/L。待大鼠骨髓间充质干细胞长至约铺满瓶底的80%时，加入感染复数为100的Adv-GFP，并定期于荧光显微镜下观察标记情况^[8]。

1.4.2 动物分组与处理 将144只SD大鼠随机分为4组，每组36只。实验动物分组与处理方法见表1。

1.4.3 骨髓间充质干细胞移植前处理 待第3代GFP标记的骨髓间充质干细胞培养融合至90%以上时，0.25%胰酶消化，1 500 r/min离心5 min后弃上清，PBS洗3次，细胞重悬于PBS，调整细胞浓度为1×10¹² L^-¹于冰盒中备用。

1.4.4 脊髓损伤模型制作和干预 大鼠造模前按300 mg/kg的剂量用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉生效后将大鼠俯卧固定，碘伏消毒，铺无菌洞巾。暴露T₆_-8的椎板和棘突，以T₇为中心取背部正中切口，咬除T₇的棘突和椎板，暴露T₇段脊髓。以T₇段脊髓后正中血管为中心，用Allen打击器以10 g×5 cm的致伤力打击脊髓，见撞击部位脊髓组织水肿、出血，大鼠双下肢及躯体回缩样扑动后双下肢瘫痪，尾巴出现痉挛性摆动表示造模成功。

联合组和骨髓间充质干细胞组在造模成功即刻于损伤中心用微量注射器注入骨髓间充质干细胞60 μL(6×10⁶个)(图1)，雌二醇组和对照组注入无菌PBS 60 μL。联合组和雌二醇组造模术后即刻肌注雌二醇250 μg/kg；骨髓间充质干细胞组和对照组术后肌注同等体积的生理盐水。

1.5 主要观察指标

1.5.1 大鼠的行为学评分 造模后1，4周时将大鼠置于开阔地，参考文献[1]建立的大鼠胸段脊髓损伤后功能评判标准(简称BBB评分法)进行运动功能评分。

1.5.2 脊髓组织超氧化物歧化酶和丙二醛水平 移植后3，7 d各组随机取4只动物麻醉后开胸取脊髓组织，迅速放在液氮中冷冻保存备用，从液氮中取出脊髓标本组织，用组织匀浆器制成100 g/L的组织匀浆，在-10 ℃ 3 500 r/min的条件下离心20 min，存于-20 ℃冰箱中待测。采用连苯三酚自氧化法检测超氧化物歧化酶水平，采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法检测丙二醛水平。

1.5.3 采用TUNEL法检测脊髓细胞凋亡情况 移植后3，7 d各组随机取4只动物麻醉后开胸取材(同前)，采用TUNEL法检测脊髓细胞凋亡情况。在判定中，随机计数20个视野中凋亡细胞数，计算平均值，计算凋亡细胞占总细胞数的百分比。

1.6 统计学分析 选择Excel2010软件整理原始数据结果，分析时应用软件SPSS20.00，计量资料用x(_)±s表示，统计学方法包括t 检验、方差分析等，检验水准α=0.05， P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

讨论

脊髓损伤是一种严重的中枢神经系统损伤，常导致不可逆的运动功能障碍和排便功能障碍。据不完全统计，仅美国每年就有超过1万例新发病例^[13]。中国的发生率约为每年60人/百万人口，已经和发达国家的高发生率水平相当^[14-15]。

脊髓损伤后主要病理变化包括大量的神经细胞死亡，轴突退变、脱髓鞘等^[16-17]。由于脊髓原发损伤和继发的大量神经细胞坏死和/或凋亡存在，可使得脊髓局部形成囊肿、空洞和瘢痕组织，影响再生神经纤维，为此对于治疗的要求比较高^[18-19]。

骨髓间充质干细胞是来源于中胚层未分化的间充质干细胞，在体内具有很强的自我更新能力；在适宜的环境下，骨髓间充质干细胞可以向各个方向分化，甚至跨胚层分化^[20]。而且骨髓间充质干细胞来源广泛，可以从自体或异体获得，易于分离、培养。骨髓间充质干细胞移植可以填充脊髓损伤区域的空腔，引导和促进神经轴突的生长，补充受损缺失的神经细胞，加速大鼠后肢功能的恢复，具有神经保护作用^[21]。内源性雌激素具有神经保护作用，流行病学研究表明脑卒中的发病率、损伤及预后与性别和体内雌激素水平密切相关，外源性给予雌二醇能明显降低脑梗死的范围，雌二醇预处理能减小皮质和纹状体的梗死体积，且不伴随脑血流量的改变^[22]。持续皮下给予雌二醇能减轻血脑屏障损伤^[23-25]。也有少数研究得到相反结论，认为长期服用雌激素或联合服用雌激素和孕激素不能改变绝经后妇女缺血性脑卒中的发病率^[26]。这些相反的研究结果可能与使用的模型、评价的方法以及人种的差异有关。

实验结果显示，造模后1，4周联合组的行为学评分明显高于骨髓间充质干细胞组、雌二醇组与对照组，说明雌二醇肌注联合骨髓间充质干细胞局部移植治疗脊髓损伤能促进大鼠行为学能力改善，有助于其运动功能的恢复。超氧化物歧化酶作为生物体内最重要的抗氧化酶之一，是体内清除氧化应激的第一道防线，存在于线粒体和细胞液之中，主要发挥清除O₂^-和防止O₂^-直接或间接转化成其他自由基形式的作用，作为检测机体氧化应激水平的指标之一，超氧化物歧化酶水平上升提示机体抗氧化能力增强。脊髓组织内含有丰富的脂质，当脊髓组织处于氧化应激状态下时，脂质上的多不饱和脂肪酸会受到活性氧簇攻击生成脂质过氧化物——丙二醛^[27-32]。丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤，在体外影响线粒体呼吸链复合物及线粒体内关键酶活性，可以通过丙二醛了解膜脂过氧化程度，间接反映膜系统受损程度，丙二醛水平下降提示机体过氧化程度减轻，抗氧化能力增强。移植后3，7 d，联合组的超氧化物歧化酶水平明显高于骨髓间充质干细胞组、雌二醇组与对照组，而丙二醛水平明显低于骨髓间充质干细胞组、雌二醇组与对照组。提示雌二醇可降低体内活性氧簇水平，使机体膜脂过氧化程度减轻，抗氧化能力增强，减少氧化应激反应。表明雌激素在脊髓损伤中可通过改善脊髓血供、清除过度产生的氧自由基等作用减轻脊髓继发性损伤，促进脊髓神经功能的恢复，有很高的应用可行性。

脊髓损伤后脊髓细胞发生凋亡^[33-37]。实验结果显示，联合组移植后3，7 d的损伤脊髓细胞凋亡率明显低于其他3组(P < 0.05)。提示雌激素能够减少脊髓损伤后继发性细胞凋亡，有助于骨髓间充质干细胞在移植区成活并促进其分化为脊髓细胞^[38-40]，这可能与雌激素提高机体抗氧化能力从而抑制神经细胞凋亡的信号转导通路有关。

总之，雌二醇能减轻脊髓损伤的继发性细胞凋亡，抑制氧化应激反应，有助于骨髓间充质干细胞移植后损伤脊髓的修复和运动功能的恢复。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞局部移植联合雌二醇肌注治疗脊髓损伤

Intramuscular injection of estradiol combined with bone marrow mesenchymal stem cell transplantation for spinal cord injury

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