CCK-8法定量检测亚甲蓝对人髓核细胞的毒性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0240

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
亚甲蓝：化学名称为3，7-双(二甲氨基)吩噻嗪-5-翁氯化物，又称亚甲基蓝、次甲基蓝、次甲蓝、美蓝、品蓝，是一种芳香杂环化合物。被用作化学指示剂、染料、生物染色剂和药物使用。亚甲蓝的水溶液在氧化性环境中蓝色，但遇锌、氨水等还原剂会被还原成无色状态。亚甲蓝高浓度时直接使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白。低浓度时，在还原型辅酶Ⅰ脱氢酶(NADPH)作用下，还原成为还原型亚甲蓝，能将高铁还原型蛋白还原为血红蛋白。临床上还试用于治疗尿路结石、闭塞性脉管炎、神经性皮炎。
细胞毒性：是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机制。有时需要进行特定物质细胞毒性的检测，比如药物筛选。

摘要
背景：前期细胞实验研究发现亚甲蓝确实对人髓核细胞具有毒性作用，且与药物浓度呈正相关，但是其毒性的临界范围未进行研究。
目的：使用CCK-8法定量测定亚甲蓝对髓核细胞毒性作用的临界范围值。
方法：选取1例椎间盘突出症患者的术后废弃髓核组织，提取髓核细胞，培养1代后制作细胞悬液，分9组接种到96孔板，空白对照只有培养基、CCK-8溶液而没有细胞；0加药对照组只有培养基、细胞和CCK-8溶液；其余7个加药组分别加入1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%，0.005%，0.001%浓度的亚甲蓝干预细胞生长繁殖。在培养24，48，72，96 h后使用CCK-8法测定吸光度，计算细胞活力并观察每一组颜色变化。
结果与结论：①颜色变化：0加药对照组颜色最深，加药组颜色与药物浓度负相关，且0.05%、0.01%、0.005%、0.001%组颜色较深并与0加药组颜色接近；②各组吸光度值均数及细胞活力：与0加药组相比，1%组吸光度减小(P < 0.05)，1%与0.5%组比较差异均无显著性意义(P > 0.05)，0.1%组吸光度及细胞活力显著高于0.5%组，0.05%组显著高于0.1%组；③结论：亚甲蓝对人髓核细胞具有细胞毒性，毒性临界值在0.1%-0.05%之间且靠近0.05%，确切值还有待于进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0002-1273-4592(冯华龙)

关键词: 亚甲蓝, 人髓核细胞, 细胞毒性, 定量研究, 组织构建, CCK-8法

Abstract:

BACKGROUND: Our preliminary study has shown that methylene blue exerts toxic effect on human nucleus pulposus cells in a concentration-dependent manner, but the toxic range remains unclear.
OBJECTIVE: To determine the critical range of the cytotoxicity of methylene blue to nucleus pulposus cells by cell counting-kit 8 (CCK-8) assay.
METHODS: The nucleus pulposus was from a patient with intervertebral disc herniation. The nucleus pulposus cells were extracted and cultured. Passage 1 cells mere used to make cell suspensions. The cells were divided into nine groups for culture: blank control (only the medium, CCK-8 solution), control (only medium, cells and CCK-8 solution), and methylene blue groups (1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 0.01% and 0.005% of methylene blue). The absorbance values were measured by CCK-8 assay at 24, 48, 72 and 96 hours after incubation. The cell viability was calculated, and the color was observed.
RESULTS AND CONCLUSION: The color in the control group was the darkest, and the color in the methylene blue groups became lighter with the concentration of methylene blue increasing, and the 0.05%, 0.01%, 0.005% and 0.001% methylene blue groups showed darker color similar to the control group. The absorbance values in the 0.1% methylene blue group were significantly less than those in the control group (P < 0.05). There were no significant differences in the absorbance values and cell viability between 1% and 0.5% methylene blue groups (P > 0.05). The absorbance values and cell viability in the 0.1% methylene blue group were significantly higher than those in the 0.5% methylene blue group, but were significantly less than those in the 0.05% methylene blue group (P < 0.05). Thus, methylene blue exerts cytotoxicity to human nucleus pulposus cells, and the critical value of toxicity is between 0.1% and 0.05% and close to 0.05%. However, the exact value needs a further investigation.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Methylene Blue, Cytotoxicity, Immunologic, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

冯华龙，何升华，黄飞强，赖居易，孙志涛，许福光，蓝志明. CCK-8法定量检测亚甲蓝对人髓核细胞的毒性[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(16): 2532-2536.

Feng Hua-long1, He Sheng-hua2, Huang Fei-qiang1, Lai Ju-yi1, Sun Zhi-tao2, Xu Fu-guang1, Lan Zhi-ming1. Quantitative study on cytotoxicity of methylene blue to human nucleus pulposus cells by cell counting-kit 8 assay[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(16): 2532-2536.

图/表（结果） 2

参考文献

[1] 何升华,冯华龙,孙志涛,等.亚甲蓝对人髓核细胞毒性的CCK-8法检测[J].中国组织工程研究,2018,22(12):1922-1927.

[2] Haciyanli M,Koruyucu MB,Erdogan NK,et al.Successful Localization of Abnormal Parathyroid Gland Using Ultrasound-Guided Methylene Blue Dye Injection in the Reoperative Neck.Indian J Surg.2015;77(Suppl 3): 1094-1097.

[3] 邱颖婕,徐忠,徐蓓,等.病毒灭活冷沉淀制备过程中滤除亚甲蓝对凝血因子的影响[J]. 临床输血与检验, 2014, (04): 413-415.

[4] 王红苹,赵树铭.亚甲蓝灭活血浆病毒的临床应用进展[J].中国输血杂志,2014 (12):1361-1363.

[5] Farrokhi MR, Yazdanpanah H, Gholami M, et al.Pain and functional improvement effects of methylene blue injection on the soft tissue around fusion site after traumatic thoracolumbar fixation: A double-blind, randomized placebo-controlled study.Clin Neurol Neurosurg.2016;150: 6-12.

[6] Findik G, Demiroz SM, Apaydin SM, et al.Computed Tomography-Guided Methylene Blue Labeling Prior to Thoracoscopic Resection of Small Deeply Placed Pulmonary Nodules. Do We Really Need Palpation? BMC Cancer. Thorac Cardiovasc Surg. 2017;65(5):387-391.

[7] Kleedehn M,Kim DH,Lee FT,et al.Preoperative Pulmonary Nodule Localization: A Comparison of Methylene Blue and Hookwire Techniques. AJR Am J Roentgenol. 2016;207(6): 1334-1339.

[8] Mazzeffi M,Hammer B,Chen E,et al.Methylene blue for postcardiopulmonary bypass vasoplegic syndrome: A cohort study. Ann Card Anaesth.2017;20(2):178-181.

[9] Vaiman M,Jabarin B,Abuita R.Corrigendum to "Methylene blue staining in the parotid surgery: Randomized trial, 144 patients" [Am J Otolaryngol 37 (2016) 22-26]. Am J Otolaryngol. 2017;38(2): 265.

[10] Xu CH,Yu LK,Cao L,et al.Value of radial probe endobronchial ultrasound-guided localization of solitary pulmonary nodules with the combination of ultrathin bronchoscopy and methylene blue prior to video-assisted thoracoscopic surgery. Mol Clin Oncol.2016;5(2): 279-282.

[11] 何升华,彭俊宇,赵祥. 经皮椎间孔镜椎间盘切除术治疗腰椎间盘突出症近期疗效观察[J]. 中国骨伤, 2011,24(1): 72-74.

[12] 丁宇,乔晋琳,崔洪鹏,等. 腰椎椎间孔镜微创手术中的区域定位原则及临床疗效观察[J]. 颈腰痛杂志, 2015,36 (5): 347-352.

[13] 黎俊,瞿玉兴,赵洪,等. 经皮椎间孔镜靶向穿刺技术治疗腰椎间盘突出症的应用进展[J]. 中国矫形外科杂志, 2015,23 (21): 1968-1970.

[14] 李广松,乔荣慧,刘伟,等. 经椎间孔脊柱内窥镜技术治疗腰椎间盘突出症合并神经根管狭窄[J]. 中国微创外科杂志, 2015, (6): 522-526.

[15] 柳百炼,熊鹰,顾邵,等. 经皮椎间孔镜治疗腰椎间盘突出症的临床效果[J]. 实用医学杂志, 2015, (06): 981-983.

[16] 潘承波, 刘法银, 李嗣生. 经皮椎间孔镜治疗腰椎间盘突出症的疗效观察[J]. 中国骨与关节损伤杂志, 2015, (01): 94-95.

[17] 张之栋,杜怡斌,储建军. 经皮椎间孔镜腰椎间盘摘除术与微创经椎间孔腰椎融合术治疗腰椎间盘突出症的前瞻性随机对照研究[J]. 中国微创外科杂志, 2015, (07): 583-587.

[18] 姚玉龙,贾惊宇,吴添龙,等.椎间孔镜下脊神经内侧支消融术治疗小关节源性下腰痛疗效分析[J]. 中国矫形外科杂志, 2015, 23(7): 600-604.

[19] 陈锦珍,向德志,何隆甫,等.肛门皮下组织亚甲蓝注射神经阻滞术用于肛肠科术后镇痛的效果观察[J]. 中国医学创新, 2015,12 (19): 144-146.

[20] 李会霞,王再见,江海燕,等. 不同浓度亚甲蓝染色对结直肠病变EMR及ESD的影响[J]. 中华腔镜外科杂志(电子版), 2015, 8(3): 202-205.

[21] 赵忠玮. 罗哌卡因、亚甲蓝及地塞米松混合液用于混合痔术后镇痛的疗效观察[J]. 沈阳医学院学报, 2015, 17(4): 220-221.

[22] 杨林青,王靖雯,李万斌,等. 亚甲蓝、纳米炭注射识别宫颈癌盆腔前哨淋巴结效果比较[J]. 山东医药,2014, 54(18): 44-46.

[23] 何向明,陈丽羽,陈波,等. 亚甲蓝联合彩超在早期乳腺癌腋前哨淋巴结活检替代腋淋巴结清扫手术中的应用研究[J]. 中国肿瘤, 2015, 24(7): 603-606.

[24] 寇德强,迟崇巍,徐虎,等. 吲哚菁绿联合亚甲蓝在乳腺癌前哨淋巴结活检中的临床应用[J]. 现代生物医学进展, 2015, 15(19): 3686-3689.

[25] 罗国庆,胡宁东,夏旭,等. 亚甲蓝染色法前哨淋巴结活检在乳腺癌手术中的应用分析(附66例报告) [J]. 临床普外科电子杂志, 2014,2(3): 35-37+43.

[26] Dinh KH, Harris AF, LaFemina J, et al. Advantages of day-before lymphoscintigraphy and undiluted methylene blue dye injections for sentinel lymph node biopsies for melanoma. J Surg Oncol.2016;114(8): 947-950.

[27] Dos Santos AF, Terra LF, Wailemann RA, et al. Methylene blue photodynamic therapy induces selective and massive cell death in human breast cancer cells. 2017; 17(1): 194.

[28] 刘春雨,金丽,彭宝淦. 硬膜外注入亚甲蓝对腰椎脊髓及脊神经节结构的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014,18(38): 6160-6164.

[29] 史剑倩. 亚甲蓝注射联合靶点射频治疗椎间盘源性腰痛的临床研究[D].南昌大学, 2014.

[30] 王朝阳. 亚甲蓝标记脊柱定位法的改进及其在腰椎退变性疾病手术定位中的应用[D].中国中医科学院, 2015.

引言

材料方法

1.1 设计分组对照观察，细胞学实验。

1.2 时间及地点 2017年1至4月在深圳北京大学香港科技大学医学中心(许可证号：SYXK，粤2010-0106)完成。

1.3 材料

人髓核细胞：于2017年1月在深圳市中医院确诊为L_4/5椎间盘突出症患者1例，由主任医师为其进行脊柱内镜手术并取其突出髓核组织。经患者知情同意，实验由深圳市中医院伦理委员会论证审核通过。

实验用主要试剂及仪器：亚甲蓝(产品目录编号：115943；EC号：200-515-2)，CCK-8试剂盒(同仁化学研究所(Dojindo)开发)，胎牛血清(Hyclone，Cat.No. SH30087.01)，RPMI-1640培养基(Hyclone，Cat.No. SH30809.01B)，青链霉素(Hyclone，Cat.No. SH30010)，PBS磷酸钾缓冲液(Hyclone，胰蛋白酶(Corning)，Cat.No.SH30256.01B)，培养皿(上海晶安生物科技有限公司)，眼科剪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，96孔板细胞培养板(NEST，Cat.No.PPP-001-030)，巴氏吸管(JET BIOFIL 3ml)，苏州安泰洁净工作台(SW-CJ-IFD)，低速离心机(中佳，SC3614)，倒置光学显微镜(OLYMPUS CKX41, U-CTR30-2)，细胞恒温培养箱(Thermo scientific, HERACELL150i)。

1.4 实验方法

1.4.1 实验设计研究将设置3个分组，A(空白组)：具有培养基和CCK溶液而没有细胞；B(0加药组)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液；C(加药组)：具有细胞、CCK溶液和药物溶液，并将加药组按加亚甲蓝浓度1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%，0.005%，0.001%分为7个小组分别为C1，C2，C3，C4，C5，C6，C7，每个小组5个复孔。

1.4.2 人髓核细胞的原代培养术中取出的突出髓核组织，无菌条件下放入PBS培养基中，快速转移至实验室超净台(确保清洁并提前使用紫外线照射30 min以上)，将髓核组织转移至培养皿，使用含青链霉素的双抗PBS快速冲洗3次，去除杂质及纤维环碎片，剩余髓核组织使用眼科剪剪碎至1 mm×1 mm×1 mm，转入15 mLEP管，离心，去溶液，按体积1∶3加入0.25%胰蛋白酶在37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养消化30 min，离心去上清后按体积1∶6加入0.25%Ⅱ型胶原酶，在恒温箱中消化2 h至基本消化完成，使用150目滤网过滤，将过滤液转移至新的 15 mLEP管，离心，去上清，加入含体积分数10%胎牛血清PBS培养基，轻柔吹打至细胞基本分布均匀，转移至培养皿，放入37 ℃，体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养，每天倒置显微镜下观察(人髓核细胞鉴定：原代人髓核细胞贴壁后多数表现为圆形或梭形，细胞胞浆充足，胞核清晰可见。传代后，细胞逐渐呈多形性改变，细胞核增大，核仁多为两三个。甲苯胺蓝染色或番红O染色结果显示越靠近蛋白多糖细胞核分布越多。免疫组化染色结果显示胞浆主要表达Ⅱ型胶原)，每2 d换液1次，待细胞贴壁并80%融合后，予以消化分组进行实验研究。

1.4.3 测量吸光度及细胞活力细胞80%融合后加入0.25%胰蛋白酶在37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中消化一两分钟，在倒置显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状悬浮于培养基上时，轻拍培养皿壁使剩余细胞脱落，同时加入适量含血清之新鲜培养基以终止消化。离心，去上清，加入适量含体积分数10%血清培养基并使用巴氏管打散细胞团块，混和均匀后，补足5 n(n为传代孔数)mL培养基。按实验设计将细胞悬浮液转移至96孔板中(100 μL/孔)并标记组别，加药组按分组加入10 μL不同浓度的亚甲蓝，将96孔细胞培养板四周加入100 μL 10% PBS防止细胞培养液挥发，放入37 ℃，体积分数5%CO₂恒温培养箱中培养。在培养24，48，72，96 h后使用CCK-8法测定吸光度(A值)，计算细胞活力并观察每一组颜色变化。

细胞活力(%)=[加药组-空白组]/[0加药组-空白组]× 100。

1.4.4 CCK-8检测方法将培养板在培养箱孵育一段适当的时间(24，48，72，96 h)，取出后去除原培养液，并用10%PBS冲洗3遍(清除药物对吸光度的影响)后加入10%PBS 100 μL，向每孔加入10 μLCCK-8溶液(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响A值的读数)。将培养板在培养箱内孵育2 h。应用酶联免疫检测仪，在450 nm双波长处测得相应吸光度(A值)。

1.5 主要观察指标 ①各组A值；②加入CCK-8试剂反应后的颜色变化；③细胞活力。

1.6 统计学分析数据以x(_)±s表示，采用SPSS 20.0统计分析，数据采用正态性检验，对数据进行组间多重比较，采用scheffe检验，检验水准为α=0.05，P < 0.05为差异并非由分组引起，具有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

讨论

亚甲蓝在临床上运用广泛，并且取得较好的临床疗效。亚甲蓝最初是作为一种解毒药，为深绿色、有铜光的柱状结晶或结晶性粉末；无臭。高浓度时直接使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白。低浓度时，在还原型辅酶Ⅰ脱氢酶(NADPH)作用下，还原成为还原型亚甲蓝，能将高铁还原型蛋白还原为血红蛋白^[2-4]。在体内借酶的参与，起着递氢体作用。不同剂量对血红蛋白效应不同，大剂量(或高浓度)治疗氰化物中毒。随着对亚甲蓝运用研究的深入，国内外研究者发现其治疗作用除解毒之外还有术中定位^[5-10]，术中镇痛，抗肿瘤，纠正感染性休克时血流动力学紊乱，抗菌及抗病毒等。

最近，随着脊柱微创理论的兴起，脊柱内镜手术在临床上运用广泛，椎间孔镜因为其独特的优势被广泛运用于临床^[11-14]。椎间孔镜在国内兴起时，大部分学者报道通过摘除大部分镜下可见的椎间盘组织来达到减压目的，后期随访发现经内镜手术的患者手术节段退变严重，椎间高度丢失明显，小关节退变严重^[15-17]。后来有研究者提出“精准减压”的概念^[18]，

亚甲蓝因为其染色特殊性(只对退变髓核组织染色)，在内镜手术上得到广泛运用。随着运用的例数增加，有研究者报道，随访发现运用亚甲蓝染色可加速椎间盘退变。因此对责任椎间盘进行亚甲蓝染色被很多研究学者所摒弃。但是因为内镜技术学习曲线陡峭，对术者解剖知识要求极高，而术中染色可以很直观地辨别退变的椎间盘，为手术带来极大的便利，因此在基层医院的脊柱内镜手术中通过亚甲蓝对椎间盘进行染色仍然被广泛运用。

亚甲蓝除了运用于脊柱内镜中，也有研究者报道其具有镇痛作用而被运用于肛肠手术中^[19-21]，主要是通过阻碍相关组织神经纤维的电传导，促进组织内丙酮酸的氧化，改变神经末梢内外的酸碱平衡环境和膜电位，从而影响神经冲动的传导性产生镇痛。另外在妇科不孕症患者的诊治中，亚甲蓝被报道运用于检测输卵管的通畅性^[22]。此外，还有学者研究发现，亚甲蓝具有抗肿瘤作用，其主要是干扰肿瘤细胞的复制过程^[23-27]。还有研究者报道通过硬膜外注射亚甲蓝缓解腰痛症状^[28-30]。因此，作者前期进行了亚甲蓝对髓核细胞的毒性定性研究，发现其细胞毒性与药物浓度呈正比(1%，2%，3%，4%，5%)，为了进一步研究亚甲蓝的最低毒性范围，设计了此研究。研究发现亚甲蓝对人髓核细胞的毒性临界值在0.1%-0.05%之间且靠近0.05%。此次研究是通过观察和测定细胞在不同浓度亚甲蓝培养基下的细胞活力及吸光度值，对于临床各科使用亚甲蓝在浓度上仅作为一个参考。临床上使用亚甲蓝染色后术者经常会使用大量生理盐水冲洗，并于术后在局部注射地塞米松抗感染，因此对于术中使用亚甲蓝的浓度还得术者自行拿捏权衡。

亚甲蓝是临床运用成熟的药物，对异常组织的染色和其特殊的药物功效为许多复杂的手术或治疗提供了方便。椎间孔镜手术在亚甲蓝染色的帮助下也是如虎添翼。虽然在各大会议中有骨科微创专家提出亚甲蓝可能加速椎间盘退变，但是，亚甲蓝对于椎间盘细胞的活性影响的研究一直未见报道。作者前期研究并结合此次研究发现较高浓度的亚甲蓝可以抑制正常髓核细胞的生长繁殖，甚至杀灭髓核细胞。而且其最低毒性浓度范围为0.1%-0.05%且靠近0.05%，因0.05%的亚甲蓝基本接近于无色，故作者认为其不适宜作为椎间孔镜手术的染色剂。但是因为术中亚甲蓝染色后术者会使用大量生理盐水冲洗，亚甲蓝浓度自然降低，故临床上使用亚甲蓝染色的最佳浓度还需要进一步的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程