淫羊藿苷体外诱导骨膜细胞增殖及分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0132

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
淫羊藿苷：主要提取自淫羊藿属植物，相对分子质量为676.65，属黄铜类化合物，是植物类雌激素中的一种，目前研究认为有减缓肾衰竭、活血化瘀、调节免疫代谢、抗肿瘤等作用。
MTT法：是目前被大量使用的检测细胞活性数量的方法，主要用于检测活性的细胞数量，其原理是活细胞内含有琥珀酸脱氢酶，而坏死细胞则不含此类酶，MTT可作用于琥珀酸脱氢酶并形成结晶，结晶的数量可反映细胞的数量。MTT法有经济、准确和快速的特点，被广泛用于细胞实验中。

摘要
背景：淫羊藿苷用于促进细胞增殖有广阔的运用前景。骨膜细胞有特定的分化方向不确定性，同时也容易被诱导增殖，常见的诱导物质包括超声、氧等物理方法或者骨形态发生蛋白7等诱导因子，目前骨组织工程的研究已经有骨膜细胞运用的相关报道。但是淫羊藿苷诱导骨膜细胞增殖相关的报道少见，淫羊藿苷诱导骨膜细胞后的分化方向目前尚未明确。
目的：探讨淫羊藿苷对人骨膜细胞增殖及分化的影响，为淫羊藿苷运用于骨组织工程提供理论依据。
方法：手术获得人骨膜，体外分离获得原代细胞，培养扩增后，种植培养骨膜细胞于24孔板中。分别用0.001，0.01及0.1 mg/L的淫羊藿苷及50 μg/L的骨形态发生蛋白7诱导骨膜细胞增殖，MTT法检测各组骨膜细胞的吸光度值。于1，3，5和7 d检测骨膜细胞碱性磷酸酶和钙结节的数量表达情况，RT-PCR法检测骨钙素、骨桥蛋白和Runx2的mRNA含量。
结果与结论：①骨膜细胞在加入淫羊藿苷后增殖良好，不同质量浓度的淫羊藿苷组及阳性对照组均有促进骨膜细胞增殖的作用(P < 0.05)；②加入了淫羊藿苷的骨膜细胞与对照组相比能产生更多的碱性磷酸酶和钙结节(P < 0.05)；③0.1 mg/L的淫羊藿苷显著上调骨钙素、骨桥蛋白和Runx2 mRNA的表达(P < 0.01)；④结果表明，淫羊藿苷有促进骨膜细胞增殖和分化为成骨细胞的作用，可作为诱导剂用于骨组织工程中种子细胞的制备。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
ORCID: 0000-0001-7928-1017(钟秀霞)

关键词: 淫羊藿苷, 骨形态发生蛋白7, 骨膜细胞, 细胞增殖, 成骨分化, 碱性磷酸酶, 钙结节, 骨钙素, 骨桥蛋白, Runx2, MTT法

Abstract:

BACKGROUND: Icariin has a broad prospect for promoting cell proliferation. Differentiation direction of periosteal cells is uncertain, but the cells are easy to be induced by ultrasound, oxygen or bone morphogenetic protein 7 (BMP7). Periosteal cells have been applied in bone tissue engineering; however, icariin effects on the proliferation and differentiation of periosteal cells is little reported.
OBJECTIVE: To investigate the effect of icariin on the proliferation and differentiation of human periosteal cells, thus providing theoretical basis for icariin applied in bone tissue engineering.
METHODS: The human periosteum was obtained and the primary cells were isolated in vitro. After culture and expansion, periosteal cells were cultured in 24-well plates, and induced by 0.001, 0.01 and 0.1 mg/L icariin and 50 μg/L BMP7, respectively. The corresponding avsorbance values of different groups were detected. The levels of alkaline phosphatase and calcium nodules in periosteal cells were measured at 1, 3, 5 and 7 days, and the mRNA levels of osteocalcin, osteopontin and Runx2 were detected at 3, 5 and 7 days.
RESULTS AND CONCLUSION: The periosteal cells proliferated well after induction with icariin, and could proliferate well in different concentrations of icariin and the positive control group (P < 0.05). Compared with the control group, the periosteal cells induced by icariin were able to produce more alkaline phosphatase and calcium nodules (P < 0.05). The mRNA expression of osteocalcin, osteopontin and Runx2 in periosteal cells could be up-regulated by icariin (P < 0.05). These findings imply that icariin can promote proliferation and differentiate of periosteal cells into osteoblasts, and it can be used as an inducer for the preparation of seed cells in bone tissue engineering.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

Key words: Phytoestrogens, Osteogenesis, Alkaline Phosphatase, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

钟秀霞，罗美兰. 淫羊藿苷体外诱导骨膜细胞增殖及分化[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(8): 1155-1160.

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图/表（结果） 3

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引言

材料方法

1.1 设计体外细胞学对比观察实验。

1.2 时间及地点于2017年1月至7月在广州中医药大学基础实验室完成。

1.3 材料淫羊藿苷(上海纯优生物科技有限公司)；DMEM-F12培养基(Gibco，美国)；骨形态发生蛋白7(天津赛尔生物技术有限公司)；胰蛋白酶(Sigma，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸(Sigma，美国)；胎牛血清(维森特生物技术(中国)有限公司)；二氧化碳恒温培养箱(Thermo，美国)；超净工作台(济南鑫贝西生物技术有限公司)；碱性磷酸酶试剂盒(上海麦约尔生物技术有限公司)；四甲基偶氮唑蓝(MTT)(Sigma，美国)；自动酶标分析仪(上海永创医疗器械有限公司)；Trizol、胶回收试剂盒、反转录试剂盒(上海钰森生物技术有限公司)；RT-PCR试剂盒(上海钰森生物技术有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 人原代骨膜细胞培养^[11] 选取1名20岁健康男性志愿者，术前签署知情同意书并已经通过伦理委员会批准。常规消毒、铺巾，于手术中，无菌操作下切取人锁骨表面约2 cm×2 cm的骨膜，仔细剔除表面软组织，切除表面结缔组织及附着的纤维组织，之后即置于DMEM-F12的培养液中，30 min内送入实验室，先用Hanks液洗涤，剪成 3-5 mm的碎块，骨膜碎块置入培养瓶后加入DMEM-F12培养液、0.125%胰蛋白酶、双抗(青霉素和链霉素)。在 37 ℃，体积分数0.05%CO₂的细胞培养箱中培养，隔天换液1次，换液时把表面悬浮碎块丢弃。1周后骨膜细胞已经覆盖细胞培养瓶底，用胰蛋白酶消化后并传代培养，每次培养3 d，取第3代细胞冻存，复苏后用于以下实验。

1.4.2 淫羊藿苷对骨膜细胞增殖的影响(MTT法) 将第3代骨膜细胞接种于24孔板中，1×10⁴/孔。实验分为3组，实验组分别加入不同质量浓度(0.1，0.01和0.001 mg/L )的淫羊藿苷，对照组加入等体积的生理盐水，阳性对照组加入50 μg/L骨形态发生蛋白7，每组均设3个复孔。分别在细胞培养1，3，5和7 d检测细胞增殖情况，检测前4 h在每孔加入20 μL 5 g/L的MTT，弃上清后加入150 μL二甲基亚砜，微孔板振荡器上振荡10 min，酶标仪检测各孔吸光度值(λ=490 nm)，测3次，取平均值。通过吸光度值反映细胞增殖情况，得出淫羊藿苷最佳浓度。

1.4.3　淫羊藿苷诱导骨膜细胞碱性磷酸酶和钙结节的表达将第3代骨膜细胞接种于24孔板中，1×10⁴/孔。实验分组同前，但在淫羊藿苷组只加入质量浓度为0.1 mg/L淫羊藿苷。实验中用碱性磷酸酶试剂盒检测骨膜细胞在第1，3，5及7天的碱性磷酸酶的表达，用Von Kossa染色法检查骨膜细胞钙结节的数量。每组均检测3次，取平均值。

1.4.4 淫羊藿苷诱导骨膜细胞成骨相应基因的表达取培养的第3代骨膜细胞，按照1×10⁷L^-1的细胞浓度接种于12孔板中后，随机分成实验组和对照组，实验组各孔分别加入10^-1 mg/L的淫羊藿苷，对照组加入等体积细胞培养液，然后于第3，5和7天收集细胞，检测骨钙素、骨桥蛋白和Runx2 mRNA的含量。每组均重复检测3次。吸去细胞培养板中的培养液后，用PBS洗涤2次，Trizol法分别裂解细胞并提取实验组和对照组细胞总RNA。Trizol溶解细胞后，加入300 μL氯仿于裂解液中，处理5 min后，调整离心机速度10 000 r/min离心15 min。离心后弃上清液并加异丙醇后再次离心，离心后再次弃上清液并用体积分数75%乙醇再次洗涤，后再次同转速离心5 min并弃上清液。加入 40 μL ddH₂O溶解沉淀，低温保存备用。按照反转录试剂盒说明合成cDNA，低温保存备用。建立PCR反应体系后，扩增目的基因，采用Delta-delta Ct法计算目的基因表达情况，引物(苏州泓迅生物科技有限公司设计)如下。

PCR引物序列
基因与引物名称	引物系列(5′to3′)
β-actin F1	TTC TAC AAT GAG CTG CGT CTG GC
β-actin R1	CTC ATA GCT CTT CTG CAG GGA GGA
Runx2 F1	GTG GAA ACC TGA TCT ATG CTT G
Runx2 R1	ATG ACT TCT GCG TCT GCG TCT GGT GAT A
骨桥蛋白F1	ACA CCG TGT GAG CAA AGC
骨桥蛋白R1	TGC CTA TAG GAT CTG GGT GC
骨钙素F1	TCA CAC AGG ACC TGA TGA CC
骨钙素R1	CCA CAA TGA TCA AGT GGC TG

1.5 主要观察指标 ①淫羊藿苷和骨形态发生蛋白7诱导下骨膜细胞不同时间点的吸光度值；②淫羊藿苷和骨形态发生蛋白7诱导下细胞不同时间点钙结节和碱性磷酸酶的表达情况；③淫羊藿苷诱导下骨膜细胞骨钙素、骨桥蛋白和RUNX2的表达。

1.6 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件包进行分析，计量资料用x(_)±s表示，不同组之间的比较用方差分析，组和组间比较用LSD法，P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

骨组织工程基本的要素之一是种子细胞，目前常用的种子细胞有骨膜细胞、骨祖细胞、成骨细胞、骨髓基质细胞和干细胞^[12-13]。骨膜细胞是位于骨表面的细胞，内有成骨细胞和软骨细胞的前体细胞，在特定的诱导情况下，有潜在的分化增殖能力，且其潜在分化能力和年龄没有关系^[14-15]。鉴于其解剖特性，目前越来越多的学者选择骨膜细胞用于骨组织工程中。可以说，骨表面的骨膜细胞是成骨细胞和软骨细胞的前体库和源头，骨膜产生新骨的特性在哺乳动物不同阶段并不一致，早期伴随骨骼的快速生长而参与其中，晚期骨膜细胞并不活跃，仅仅参与骨骼损伤后的修复^[16-18]。骨膜细胞特定条件下诱导的分化方向不同，一般可向成骨及软骨方向分化，有学者证实其诱导骨髓基质干细胞定向分化的作用^[19-20]。当前实验通过构建体外细胞培养体系，MTT检测骨膜细胞增殖，系统研究淫羊藿苷诱导骨膜骨膜细胞分化。发现骨膜细胞表达的骨钙素、骨桥蛋白和Runx2的mRNA均比对照组高，说明淫羊藿苷能有效的诱导骨膜细胞增殖分化为成骨细胞。同时发现相应成骨特异mRNA的表达量和阳性对照组骨形态发生蛋白7组无明显差别，说明0.1 mg/L淫羊藿苷对骨膜细胞的诱导效应和骨形态发生蛋白7相当。骨形态发生蛋白7作为骨形态发生蛋白家族的重要成员，已经被证实有明显的诱导骨膜细胞成骨作用^[21]。选用骨形态发生蛋白7作为阳性对照组能进一步说明淫羊藿苷对骨膜细胞的诱导分化作用。

淫羊藿苷对细胞的刺激和诱导作用被广泛证实，有学者证实骨髓基质干细胞可被淫羊藿苷诱导增殖分化成骨细胞或脂肪细胞^[22-24]；淫羊藿苷能促进脂肪干细胞向成骨方向分化，也具有抑制破骨细胞活力，减弱其分化扩增作用^[25]。目前淫羊藿苷诱导骨膜细胞分化尚无相关报道，课题组建立体外培养细胞体系，通过检测成骨特异因子论证淫羊藿苷对骨膜细胞的调控成骨作用，为骨组织工程提供了一种新的种子细胞和诱导剂的选择方向。

为验证淫羊藿苷对骨膜细胞的具体分化方向，实验检测了不同时间点碱性磷酸酶和钙结节的表达，二者均可作为成骨特异性检测标准^[26-27]。结果发现淫羊藿苷能促进骨膜细胞分泌和表达碱性磷酸酶和钙结节，且其表达量和骨形态发生蛋白7对比无显著差异，说明淫羊藿苷促进成骨标志物分泌的效应和阳性对照物骨形态发生蛋白7类似。实验还进一步检测了相应的成骨特异基因，钙结节、碱性磷酸酶、骨钙素、Runx2等。Runx2是成骨细胞增殖分化的特异调控因子，同时也对破骨细胞有重要作用，是维持骨动态平衡和代谢重要的转录因子。Runx2可通过调控细胞内外特异蛋白转录参与细胞增殖分化，对骨的形成有正向促进作用^[28-30]。骨细胞增殖、矿化和代谢必须的酶是碱性磷酸酶，是成骨细胞的标志性酶，其含量的高低和细胞分化的成熟度密切相关，同时其活性也反映成熟骨细胞的比例和数量，并可代表细胞矿化的潜力，碱性磷酸酶高说明成骨细胞数量多，前体细胞数量相对少，说明成骨分化更成熟^[31-32]。但是碱性磷酸酶在人体多个器官中均有表达，也要注意其广泛性。有研究证实淫羊藿苷能促进碱性磷酸酶分泌，并进一步促进成骨细胞增殖实验选用成骨检测的标志基因是Runx2、骨钙素和骨桥蛋白，均是直接参与到骨细胞矿化过程中的重要因子，可综合多方面论证骨膜细胞被淫羊藿苷诱导成骨的特性^[33]。实验结果发现淫羊藿苷能在第3，5和7天明显促进骨膜细胞分泌骨钙素、Runx2和骨桥蛋白mRNA，说明淫羊藿苷明显促进了骨膜细胞成骨方向的分化。结合阳性对照物骨形态发生蛋白7的促进成骨分化作用，进一步论证了淫羊藿苷有促进骨膜细胞成骨性分化的效果。

综上所述，实验用植物雌激素淫羊藿苷作为组织工程的诱导剂并探讨其分化方向，经过研究发现淫羊藿苷能促进骨膜细胞向成骨方向分化，且其诱导分化能力和骨形态发生蛋白7无明显差异。因此淫羊藿苷可作为组织工程的待选诱导剂。MTT、荧光定量PCR等方法证实了淫羊藿苷的促细胞相关作用，为骨组织工程选用良好有效的诱导剂奠定了理论基础。此外，此次实验选用的骨膜细胞因其容易培养及取材等生物学特点，可作为首选的骨组织工程种子细胞。

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