内皮祖细胞在血管内皮细胞损伤后的修复和血管新生中发挥着重要作用,研究显示,内皮祖细胞在体内、外均能定向分化为成熟的内皮细胞,促进血管的形成
[11]。Hill等
[12]研究发现内皮祖细胞可作为预测血管功能和心血管危险度的指标,内皮祖细胞数量的减少和老化的加速预示血管内皮细胞修复能力的降低,心血管疾病发生率增加。因而改善内皮祖细胞的数量和功能对于治疗冠装动脉粥样硬化性心脏病、肢体缺血等疾病具有重要的意义。
目前有关内皮祖细胞的鉴定一直存在争议。正在分化生长的内皮源细胞能够吞噬ac-LDL,而UEA-1又是内皮祖细胞的表面标记之一,故用DL-ac-LDL与FITC-UEA-1双荧光染色得到的双阳性细胞目前被认为是正在分化的内皮祖细胞[13]。但近来有研究表明,以CD34/CD133/VEGFR2这3种表面标志物阳性来定义内皮祖细胞,较采用双阳性标记能更好地减少异质性[14]。因而本文中使用倒置荧光显微镜观察Dil-ac-LDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞,并采用免疫组织化学法检测内皮祖细胞的特异性标志fik-1、vWF、CD34及VEGF的表达,这就从细胞表面标志物和功能等方面证实了细胞为正在分化的内皮祖细胞。
补阳还五汤是收载于《医林改错》中的经典方剂,用于治疗脉络瘀阻,筋脉肌肉失却濡养的瘀证。方中重用黄芪大补脾胃元气,令气旺血行,瘀祛络通,为君药;当归化瘀而不伤血为臣药;川芎、赤芍、桃仁、红花活血祛瘀,地龙通经活络为佐药;全方共奏补气活血通络之功。现代药理研究表明,黄芪具有促进血管再生,抑制血细胞聚集,降低血液黏度,改善微循环作用,当归能扩张冠脉,促进微循环,改善心肌缺血,抑制血小板聚集[15]。
近年来,补阳还五汤在临床上广泛用于治疗心、脑血管疾病及外周肢体缺血性疾病[16-17]。徐军等[18]报道补阳还五汤中的黄芪能促进血管内皮细胞增生,提高内皮细胞整合素活性,具有良好的促进血管生成和刺激NO产生作用,组方中其他单味药也通过对内皮细胞受损后所表达的促血栓因子的影响,保护内皮细胞功能。欧明娥等[9,19] 发现补阳还五汤的原方提取物以及含有的生物碱、苷等可提高血管内皮细胞的抗凝、纤溶活性,并可通过抑制凝血酶激活PKCα信号途径而发挥活化血管内皮细胞、拮抗血栓形成的作用。
吴健宇等[20]研究表明补阳还五汤能提高正常或自由基损害的血管内皮细胞增殖能力,使内皮细胞的分泌功能趋于正常,从而防止血栓和动脉硬化的发生。由于补阳还五汤与内皮祖细胞在治疗缺血性和血管新生障碍性疾病上的相似性,作者推测两者是否存在一定的关联?
本实验通过补阳还五汤对内皮祖细胞干预试验后发现,补阳还五汤能显著提高内皮祖细胞的数量、增殖、迁移和黏附功能,并且与药物浓度存在着相关性,以 50 g/L补阳还五汤组效果最为明显;此外,补阳还五汤还能增加内皮祖细胞分泌NO和表达VEGF。由此可见,补阳还五汤不但可直接对内皮细胞具有保护作用,并且可同时增加内皮祖细胞的数量并改善其功能,从而促进内皮修复。这就从内皮祖细胞功能的改善这一角度阐明了补阳还五汤治疗心、脑血管疾病及外周肢体缺血性疾病的机制,为进一步的研究和应用提供了参考。
补阳还五汤具体是通过何种机制影响内皮祖细胞的数量和功能尚不清楚。研究表明,NO在内皮祖细胞的动员和分化过程中发挥重要作用,NO的减少影响内皮祖细胞的数量和功能[21-23]。Sumi等[24]则证实P13K/Akt信号通路在促进内皮祖细胞增殖、迁移和分化成熟中发挥着重要作用。本实验发现在补阳还五汤作用后,NO含量可显著增高,推测是否补阳还五汤有效组份可以激活内皮祖细胞中P13K/Akt信号通路,导致NO分泌的增加,进而促进了内皮祖细胞的增殖及其各种功能的增强;此外,Notch/Jagged1、AMPK等信号通路也参与了内皮祖细胞的增殖与分化[25-26],补阳还五汤是否通过这些信号途径而对内皮祖细胞发挥作用,这尚需进一步的研究。再有,研究表明补阳还五汤可以提高内皮素1、内皮型一氧化氮合酶的活性[27],调节氧化应激水平[28],这些均会对内皮祖细胞的数量和功能产生影响。
Hur等[29]最早提出外周血内皮祖细胞有两种不同的细胞亚群,即早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞。早期内皮祖细胞呈纺锤形,两三周生长达到高峰,第4周死亡,以分泌VEGF为主;晚期内皮祖细胞呈“铺路石样”,2~4周出现,4~8周呈指数生长,第12周死亡,主要分泌NO。
Yoon等[30]进一步研究指出晚期内皮祖细胞更易与血管内皮细胞单层融合,具有更强的管腔形成能力。在本实验中,不同质量浓度的补阳还五汤都能明显的促进内皮祖细胞分泌NO,而对VEGF的表达影响较弱,只有50 g/L补阳还五汤培养基有轻微的促进VEGF分泌的作用,这可能的解释是:补阳还五汤提取液能促进内皮祖细胞向晚期内皮祖细胞的分化,本实验中使用的内皮祖细胞在研究前培养了16 d,经补阳还五汤处置后,却表现出了晚期内皮祖细胞分泌NO的特征,这说明补阳还五汤能促进了它们的分化,更有利于内皮祖细胞数量的增加和融合至血管内皮细胞单层,加快缺血组织的血管新生。
总之,通过以上实验发现补阳还五汤能明显的增加外周血内皮祖细胞的数量,改善内皮祖细胞的功能,促使晚期内皮祖细胞的分化,更好的促进缺血组织的功能改善,这为心肌梗死、动脉硬化和肢体缺血等疾病的治疗提供了理论基础。但对于补阳还五汤对内皮祖细胞作用的分子生物学机制,尚需进一步的研究和探讨。