3.1 关于非细胞型组织工程复合物的构建 由骨膜来源的骨祖细胞成骨能力强但增殖能极弱,不适合作为种子细胞,而自体红骨髓中的骨髓间充质干细胞作为种子细胞具有高度增殖及多向分化潜能,分化方向具有一定特异性
[10-12]。尽管已有研究表明红骨髓中基质干细胞少于1/10
5并且会影响成骨
[13-14],李亚非等
[14]实验表明红骨髓中的纤维蛋白是骨生长因子的优良载体,红骨髓内的间充质干细胞骨形态发生蛋白诱导下分化增殖,可提高单位体积内基质干细胞、成骨细胞数量及活性,诱导
内源性成骨细胞及干细胞聚集,增强新骨活性,促进新骨生长。该方法操作简便,临床实用性强。骨诱导活性材料既能补充定量外源性并证明有诱导活性的骨形成蛋白,又能复合在能使骨形成蛋白缓释的天然三维互相交通的网孔结构载体内。自体红骨髓与骨诱导活性材料复合构建成具有种子细胞、骨生长因子和吸附载体为一体的非细胞型组织工程骨,并具有良好的骨诱导、骨传导作用[15]。
3.2 血管化对成骨过程的影响 骨缺损的修复过程包括血肿形成、血肿机化、骨痂形成和骨痂改建几个阶段,此过程需要3个必要条件即诱导因子、干细胞及合适的营养空间环境,干细胞通过血液循环到达修复区并在诱导因子的作用下定向分化成为成骨细胞,成骨细胞分泌胶原,通过骨形成蛋白和骨钙素作用,形成骨痂而后改建成正常骨组织。在此过程中外源性或内源性种子细胞凋亡总是不可避免,已有的研究发现种子细胞只有血管周围200 µm左右范围内才能通过弥散营养及氧气而存活[16]。在本实验中组织学苏木精-伊红染色显示实验组4周时交界区及中央部位即可见成团软骨细胞分布,并可见软骨团内微血管存在,而对照组植入材料中央区域无任何血管组织仅在交界区存在大量软骨细胞及少数血管组织,8周时苏木精-伊红染色可清晰观察到周围新生骨小梁存在是以血管簇为中心的,这一方面提示本实验中的骨修复应该是以软骨内成骨为主,另一方面也可以看出实验组的成骨方式应是以自四周长入的血管为中心的多中心成骨与自两端交界区锥形长入汇合并存,这无疑加速了植入物向自体骨转化的进程。
骨组织形态计量学简称骨计量学,检测则是制作组织切片,通过对显微镜下骨组织二维平面的测量,根据体视学原理,推测或转换获得三维参数,属于有损伤检测,能够更加客观的反应出修复区内新生骨痂生长及植入材料转化为自体骨的情况,通过比较形态和组织学观察结果,两组同一时间点无论植入物内部血管的长入、外骨痂、骨小梁及软骨组织形成的数量和速度,还是成熟骨结构的形成、骨干结构的重塑、骨髓腔的再通、植入物的吸收降解,实验组体内成骨的能力和修复骨缺损效果均优于对照组。在12周时两组间进行的三点弯曲最大负荷试验评价整段骨缺损的力学性能,显示实验组的极限载荷明显高于对照组,可见早期血管化不仅对植入的种子细胞有营养支持作用,也能在后续的骨修复过程中持续提供内源性干细胞及成骨细胞,维持种子细胞浓度,通过血运的及时重建保证组织工程骨转化为自体骨并发挥生物学效能。
3.3 关于膜引导作用的观察 骨缺损的愈合过程中,成纤维细胞向缺损区生长移行速度快于具有骨潜能的间质细胞,进而影响骨愈合[17-19]。本实验通过不同时间段的大体观察及组织学检查,在膜引导作用下两组均未发现骨断端之间纤维结缔组织夹垫长入,并且骨干塑形良好,对照组的植入材料爬行替代缓慢,但外骨痂生长较好,16周时尽管骨髓腔通畅但仍可见部分骨诱导材料残留,而实验组在16周时骨诱导材料已完全被自体板层状骨所替代,骨髓腔通畅。X射线片显示4周时实验组修复区周围已有骨痂形成,而对照组未发现明显骨痂。通过实验观察,在去除外骨膜条件下,对照组是以膜外骨痂生长弥补植入材料替代缓慢及力学强度不足,国内外学者用聚氨基甲酸酷膜在骨膜外包裹挠骨缺损实验认为膜引导性骨再生模型修复缺损主要靠外骨痂,膜管内成骨组织少[20-21],这与本实验的结论一致,但是实验中发现应用膜引导技术早期所产生的外骨痂并非完全环形包绕骨修复区,并且随植入材料逐渐转化为自体骨,外骨痂也逐渐减少,这应该与力学环境下骨干再次塑形有关。本实验中以筋膜瓣为膜材料利用膜引导性骨再生技术修复缺损具有普通生物膜无法比拟的优势[22],除能促进外骨痂生长同时也能通过血运的及时建立及供给促进植入材料更快的转化为自体骨。
综上所述,以带血运筋膜瓣作为膜引导材料在动物体内构建组织工程骨除可以阻隔结缔组织长入并浓聚相关诱导因子还可以起到早期血管化的目的,成骨过程是以随血管生长而发生的多中心成骨同时伴有诱导膜外骨痂生长早期增强力学强度的作用,为临床开展修复大段骨缺损提供了一种新型方法。