丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合人胎盘间充质干细胞修复桡骨节段性骨缺损

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.51.002

摘要/Abstract

摘要：

背景：丝素蛋白用于骨重建和再生，表现出机械稳定性和持久性。但单纯的丝素蛋白存在一定的缺陷，在含水量极低时易于破碎，在低湿环境应用时强度不够，通过与其他多聚物的复合可以进一步改进丝素蛋白的结构和特性。
目的：观察胎盘间充质干细胞联合丝素蛋白/羟基磷灰石材料修复节段性骨缺损的效果。
方法：制作兔桡骨中段1.5 cm长骨缺损模型，以数字表法随机分为实验组(植入BrdU标记人胎盘间充质干细胞/丝素蛋白/羟基磷灰石)和对照组(植入丝素蛋白/羟基磷灰石)。植入后4，8，12周行大体、组织学与X射线观察，评分比较骨缺损修复情况。
结果与结论：胎盘间充质干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合培养植入后，4周时新骨已开始形成，8周时骨缺损部分修复，12周时有部分新生骨组织形成板层骨，骨小梁形成，内可见大量成骨细胞，而对照组支架材料降解较慢。植入后第12周实验组影像学检测骨缺损区完全修复，皮质连续，塑型完全，不易分辨。对照组缺损区基本修复，但塑型不佳，缺损区易分辨，实验组新骨生成优于对照组。说明丝素蛋白/羟基磷灰石材料与胎盘间充质干细胞联合移植能够较好修复兔桡骨缺损。

关键词: 胎盘间充质干细胞, 丝素蛋白, 羟基磷灰石, 组织工程, 骨

Abstract:

BACKGROUND: Silk fibroin can be used for bone reconstruction and regeneration, showing the mechanical stability and durability. Silk fibroin alone has some shortcomings, it s easily broken at very low water content, and not enough strong in low humidity environments, compounding with other polymer can further improve the silk fibroin structure and properties.
OBJECTIVE: To observe the effect of placenta mesenchymal stem cells (PMSCs) combined with silk fibroin/hydroxyapatite (SF/HA) materials in repairing rabbit bone defects.
METHODS: A 15-mm length of radius defect model was established in rabbits, which were randomly divided into experimental group and control group, implanted with BrdU-labeled PMSCs/SF/HA and SF/HA respectively. The gross observation, histological and radiographic examinations were analyzed on 4, 8, and 12 weeks after transplantation to evaluate bone defects repair.
RESULTS AND CONCLUSION: After PMSCs/SF/HA implantation, new bone formation at 4 weeks, bone defects were partially repaired at 8 weeks, and some new bone tissues formed lamellar bone and bone trabecular at 12 weeks, with a large amount of osteobloasts were seen, while the scaffolds degraded slowly in the control group. X-ray observation of the experiment group at 12 weeks after operation showed the bone defects were completely repaired, with continuous cortex, complete molding and cannot be distinguished. In control group, the defects were almost repaired, but the molding was poor and the defects can be detected. The new bone formation in the experimental group was better than that in control group. PMSCs/SF/HA composites transplantation can repair the radius bone defect in rabbits.

中图分类号:

R318

钱寒光，苗宗宁，赵基栋，彭玮. 丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合人胎盘间充质干细胞修复桡骨节段性骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(51): 9807-9511.

Qian Han-guang, Miao Zong-ning, Zhao Ji-dong, Peng Wei. Human placenta mesenchymal stem cells seeded on a silk fibroin/hydroxyapatite scaffold for repair of radius segmental bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(51): 9807-9511.

参考文献

引言

材料方法

讨论

在骨组织工程的实验研究中，种子细胞的来源、分离纯化、规模化扩增等是制约其发展的重要瓶颈问题之一。间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一类多能干细胞，在特定诱导条件下可分化为多种类型的结缔组织，形成骨、软骨、骨骼肌、肌腱、神经和脂肪等多种组织^[7-10] ，而且具有采集方便、易于体外培养、扩增和诱导等特性，被认为是一种理想的种子细胞。目前，间充质干细胞来源的研究主要集中于骨髓，间充质干细胞在成人骨髓内含量极低，占有核细胞数的0.01%~ 0.001%，骨髓间充质干细胞的数量和分化能力随着年龄的增长而减少和减弱^[11-16] 。本实验结果表明可以从胎盘组织分离培养间充质干细胞，并且这些细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的细胞生物学特性^[16] 。由于可以在体外预先建立胎盘间充质干细胞库，实现即时使用，所以胎盘间充质干细胞在组织工程研究中具有广阔的应用前景。
近年来在组织工程支架材料的研究中，丝素蛋白引起高度重视。丝素蛋白作为生物材料有以下优点：①较其他天然纤维机械特性好，能与许多高性能的纤维媲美。②可加工成膜支架或其他形式。③表面易化学共价修饰黏附位点和细胞因子。④可通过遗传工程改造丝蛋白成分来调节相对分子质量的大小、可结晶性和可溶性。⑤可部分生物降解，降解产物不仅对组织无毒副作用，还对周围组织有营养与修复作用^[17-18] 。Meinel等^[19]首次将丝素蛋白做成三维多孔丝素蛋白支架用于骨组织工程研究，先将人骨髓间充质干细胞种植于支架，再植入鼠头盖骨创伤模型，说明丝素蛋白可用于骨重建和再生，表现出机械稳定性和持久性。
蚕丝由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，去掉丝胶蛋白后会降低丝素蛋白的机械属性^[20-21] 。单纯的丝素蛋白存在一定的缺陷，例如纯丝素膜在含水量极低时易于破碎，在低湿环境应用时强度不够，结晶区偏少也会导致丝素膜在溶液中的溶失率较高等，使其在某些应用中受到限制，为此目前研究的一个热点是希望通过复合材料性能互补的原理，来多方位的改善丝素膜的物理性能^[22-23] 。通过与其他多聚物的复合可以进一步改进丝素蛋白的结构和特性，例如丝素蛋白与纤维素、壳聚糖、胶原等混合^[24] 。Liu等^[25]使用去甲二氢愈创木酸作为交联剂使丝素蛋白保持自然的机械属性，在体内和体外比较脱胶后的丝素蛋白和用去甲二氢愈创木酸改性后的丝素蛋白的物理性质和生物相容性。Gobin等^[26]探讨用丝素蛋白和壳聚糖共混支架治疗豚鼠疝气的可行性，发现丝素蛋白和壳聚糖共混支架是一种用于临床重建的潜在材料。从本实验看，胎盘间充质干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合培养植入后4周新骨已开始形成，8周时骨缺损部分修复，12周时实验组有部分新生骨组织形成板层骨，骨小梁形成，内可见大量成骨细胞，而对照组支架材料降解较慢，并且动物状态良好，无死亡。说明在体内微环境影响、应力因素作用及血液供应等条件下，间充质干细胞与丝素蛋白/羟基磷灰石材料复合构建的组织工程骨可以修复骨缺损。
制备合适的骨缺损动物模型，是进行骨组织工程研究的前提。实验性骨缺损需要有一些不利于骨生长的因素存在。如骨缺损不能自行修复的长度，缺损部位血供差，红骨髓含量少的成年动物。本实验中选用成年兔桡骨制备15 mm骨缺损模型，缺损长度达其骨干直径的四五倍，中段缺损远离红骨髓较丰富的干骺端，且桡骨中段位置表浅，表面为较薄的伸趾肌腹与肌腱移行处，没有较粗大肌组织附着，只有少量肌肉覆盖。这些因素均不利于骨缺损的自行修复。表明15 mm桡骨缺损是兔不能自行愈合的，符合骨缺损的要求。BrdU作为一种嘧啶类似物，在细胞处于DNA合成期掺入到新合成的DNA中并在其中长期存留，标记BrdU的细胞在不受到紫外线的照射的情况下对细胞没有功能损害。近年来，国内外已有人将该技术应用到移植细胞的存活、分化和功能状态的跟踪检测，标记和检测的准确性高、标记率高、方法简便、迅速、安全，是反映细胞增殖及跟踪监测移植细胞的理想指标。
本实验表明丝素蛋白/羟基磷灰石材料与胎盘间充质干细胞联合移植能够修复兔桡骨缺损，胎盘间充质干细胞异种移植后仍具有成骨潜能。丝素蛋白/羟基磷灰石材料与胎盘间充质干细胞可以作为组织工程骨支架材料和种子细胞的来源。但是适当的细胞植入数量以及临床植入时机仍有待于进一步研究。

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