无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.19.005

摘要/Abstract

摘要：

背景：传统的胚胎来源和脑来源的神经干细胞由于取材困难，并受伦理道德的约束，应用受到极大限制。
目的：拟利用无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞。
方法：抽取大鼠股骨和胫骨的骨髓，采用全骨髓培养及贴壁筛选法分离培养骨髓间充质干细胞，流式细胞仪检测细胞周期及细胞免疫表型，油红O染色及茜素红染色鉴定其成骨、成脂能力。取传至4~6代的大鼠骨髓间充质干细胞，加入含表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、B27的DMEM/F12无血清神经培养基进行诱导，采用免疫荧光染色及流式细胞仪予以鉴定。
结果与结论：P5骨髓间充质干细胞(91.5±3.1)%处于G1期，高表达CD90及CD29，不表达CD45及CD34，成脂诱导后在胞质中可见桔红色脂滴，成骨诱导后可见黑色矿化结节。骨髓源性神经干细胞巢蛋白免疫荧光染色呈阳性，流式细胞仪检测其阳性率为(97.2±1.1)%，NSE，β-Tubulin，GFAP及MAP-2抗原免疫荧光染色均呈阳性表达。表明在无血清神经培养基中加入特定生长因子，骨髓间充质干细胞可诱导为神经干细胞；在体外适当条件下，骨髓源性神经干细胞具有增殖和分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。

关键词: 无血清培养, 巢蛋白, 骨髓源性, 神经干细胞, 骨髓间充质干细胞

Abstract:

BACKGROUND: The application of embryo or brain-derived neural stem cells has been greatly hampered by ethical and moral constraints or technical difficulties.
OBJECTIVE: To culture SD rat bone marrow-derived neural stem cells in vitro using serum-free neural induction medium.
METHODS: Bone marrow mesenchymal cells (BMSCs) were collected from rat femurs and tibias, which were isolated and cultured by the whole bone marrow culture and adherence method. The cell cycle and immunophenotype were detected by flow cytometry, and the osteogenic and adipogenic potential were identified by oil red O staining and alizarin red staining. The 4-6 generations of BMSCs were incubated to differentiate into bone marrow-derived neural stem cells under serum-free medium containing epidermal growth factor, basic fibroblast growth factor and B27, followed by DMEM/F12 supplemented with fetal calf serum, the differentiated cells were identified by immunofluorescence and flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: (91.5±3.1)% of the P5 BMSCs were in G1 phase, which highly expressed CD90 and CD29, but not expressed CD45 and CD34. Reddish yellow lipid droplet could be seen after osteogenic induction, and black mineralized nodules could be found after adipogenic induction. Bone marrow-derived neural stem cells were positive to nidogen immunofluorescence staining, and the positive rate was (97.2±1.1)%. The cells expressed neuron specific enolase, β-Tubulin, glial fibrillary acidic protein as well as microtubule-associated protein-2 antigen. It demonstrated that BMSCs can differentiate into neural stem cells under the induction of serum-free neural induction medium combined with certain growth factors. And the bone marrow-derived neural stem cells have the ability of differentiation into neurons, astrocytes or oligodendrocytes.

中图分类号:

R394.2

陈静娟，李华，许志恩，柯俊龙. 无血清神经培养基体外培养大鼠骨髓源性神经干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(19): 3441-3445.

Chen Jing-juan, Li Hua, Xu Zhi-en, Ke Jun-long. Culture of bone marrow-derived neural stem cells using serum-free neural induction medium[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(19): 3441-3445.

参考文献

引言

材料方法

讨论

骨髓间充质干细胞是指一群具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞和骨髓基质甚至肝脏细胞和神经细胞等多种分化潜能的干细胞，能被诱导分化为3个胚层细胞，其能向神经细胞分化的特性逐渐吸引研究人员的注意。成体来源的骨髓源性神经干细胞不但避免了从脑组织获取神经干细胞的危险性和局限性，也避免了胎儿组织移植中存在的伦理、免疫排斥、来源有限等问题的束缚，而且具有能在体外大量快速扩增的优点。国内外大量实验证明，只要给予适当的条件，它就可以分化成神经细胞，且植入体内能改善神经功能缺损症状，为神经干细胞的来源提供一个新途径。实验按照Friendenstein等^[7]方法，直接把骨髓细胞悬液接种在塑料瓶中，利用其贴壁生长的特性获取，经换液、传代来纯化细胞，通常把P5以后较为均一的细胞认为是骨髓间充质干细胞。在形态学方面，骨髓间充质干细胞多呈长梭形，细胞边界清楚，胞核居中，细胞排列有一定的方向性，成放射状或漩涡样排列。目前国内外学者尚未发现骨髓间充质干细胞具有特征性的表面标志，其可表达间质细胞、内皮细胞、表皮细胞等表面标志，一般认为CD90，CD71，CD44，CD29，CD105，CD106等是骨髓间充质干细胞的重要表面标志物，并缺乏CD34，CD45等造血细胞的表面标志。而多向分化潜能性是其最重要的特性。实验从细胞的形态、表型及向脂肪细胞及成骨细胞分化特性证实为培养的细胞是较纯的骨髓间充质干细胞，与Anokhina等^[8-11]报道的结果一致。G₀/G₁期占整个细胞群的比例达90%，说明骨髓间充质干细胞大部分处于静止期，并具有高分化潜能，符合骨髓干细胞特征。目前体外诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的方法主要有：①以抗氧化剂为基础的诱导方案。代表方案是Woodbury等^[12]用抗氧化剂β-巯基乙醇或二甲基亚砜/丁羟茴香醚等体外诱导成年大鼠和人骨髓间充质干细胞分化。骨髓间充质干细胞呈现为神经元形态，同时表达神经元特异性烯醇化酶、神经元核抗原和神经微丝2M等神经细胞标志物。目前抗氧化剂诱导的机制还不清楚，但有关于抗氧化剂诱导的报道已经很多。②以提高胞内cAMP为基础的诱导方案。代表方案为Deng等^[13]联合应用异丁甲基黄嘌呤和双丁酰环腺苷酸提高骨髓间充质干细胞的胞内cAMP含量，机制是cAMP浓度的增加会激活经典的PKA途径、影响MEK-ERK信号，使部分转录因子表达的增加，从而影响骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化。③骨髓间充质干细胞在体外与神经细胞共培养方案。有研究发现，星形胶质细胞能够明显促进骨髓间充质干细胞向神经元方向分化。④以无血清神经培养的诱导方案。2002年Jiang等^[14]通过条件培养基长期培养后获得的骨髓间充质干细胞具有非常广泛的分化潜能，形成的终末组织包括脑、视网膜、肝、肠、脾、骨髓、血液、皮肤等。一方面说明了骨髓间充质干细胞具有跨胚层分化的能力，另一方面说明在适当的培养环境下，骨髓间充质干细胞能诱导向多种细胞分化。实验采用的是神经干细胞培养的专用无血清培养技术^[15-16]，其原理是利用特殊的培养基是去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长因子等干扰因素，使非神经干细胞无法较长时间成活，而自然状态下分离筛选出能够存活并增殖的神经干细胞群体。在没有氧化剂等诱导剂的情况下，仅通过骨髓间充质细胞含血清的培养环境改变为无血清神经培养环境，获取骨髓源性神经干细胞，方式简便易行，神经干细胞易于成活。另外，由于处理因素较少，对下一步的细胞分化调控机制及细胞信号通路的研究非常有利。 2000年Gage^[1]将神经干细胞描述为一类具有多向分化潜能的细胞，能分化成神经系统的细胞即神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，而且具有自我更新和维持的能力。实验在无血清培养条件下，将骨髓间充质干细胞诱导分化为神经干细胞，能不断分裂增殖，形成神经球，并表达巢蛋白，与Sauerweig等^[17]结果相同。在同样条件下，骨髓间充质干细胞能不断传代形成新的神经球。骨髓源性神经干细胞表达巢蛋白，该蛋白目前已作为神经干细胞的特征性生物学标志被广泛应用于神经干细胞的鉴定。在含有血清培养条件下，神经干细胞能分化为NSE阳性的神经元、GFAP阳性的星形胶质细胞、MBP阳性的少突胶质细胞，表明形成的细胞球具有分化为中枢神经系统3种主要细胞的能力。骨髓源性神经干细胞的研究仍处于初始阶段，临床应用还存在一些问题有待解决：①骨髓间充质干细胞转分化的机制尚未明确。②优化现有的骨髓源性神经干细胞的分化条件，寻找更高效的培养方法。③骨髓源性神经干细胞在体内的成活率及增殖、迁移、归巢和锚靠停留等情况还需要进一步分析。④骨髓源性神经干细胞是否真的具有神经细胞的功能，能否和宿主之间建立新的神经通路尚待研究。此外，目前药物的筛选大多采用整体动物模型或细胞株作为进行药理、毒理试验的检测系统。但是动物模型难以反映正常人类细胞的反应性，若以成体干细胞体外分化作为正常人类发育的模型，将可能作为很好的药物筛选平台，为今后个体化治疗带来革命性进步。

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