中国组织工程研究 ›› 2010, Vol. 14 ›› Issue (19): 3431-3435.doi: 10.3969/j.issn.1673-8225.2010.19.003
• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇 下一篇
兔骨髓间充质干细胞体外向心肌样细胞诱导分化：缝隙连接蛋白43的表达变化
周浩粤1，邱汉婴2，卢炯斌1，李学东1
- 1汕头大学医学院，广东省汕头市 515000；
2汕头大学医学院第二附属医院心内科，广东省汕头市 515000
Differentiation of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells into cardiomyocytes in vitro following induction: Changes in connexin 43 expressionv
Zhou Hao-yue1, Qiu Han-ying2, Lu Jiong-bin1，Li Xie-dong1
- 1Medical College, Shantou University, Shantou 515000, Guangdong Province, China;
2Department of Cardiology, Second Affiliated Hospital, Medical College, Shantou University, Shantou 515000, Guangdong Province, China
摘要：
背景：骨髓间充质干细胞经过诱导因素刺激后，能够分化为心肌细胞，同时表达缝隙连接蛋白43，移植后可改善心功能或修复受损的心脏起搏传导系统。而缝隙连接蛋白43在维持心脏正常功能中发挥着重要作用。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞过程中缝隙连接蛋白43的表达变化，及诱导后骨髓间充质干细胞间隙连接通讯功能的改变。 方法：采用Percoll非密度梯度离心法与贴壁法分离培养兔骨髓间充质干细胞，正常组不进行任何干预，诱导组加入5-氮胞苷向心肌样细胞诱导，免疫荧光及流式细胞仪检验细胞诱导前后缝隙连接蛋白43的表达。将原代培养1 d的乳鼠心肌细胞分别接种于上述两组细胞爬片上，免疫荧光观察兔骨髓间充质干细胞与心肌细胞形成间隙连接的情况。划痕试验设立正常组、诱导组以及添加甘草次酸的阻滞剂组，观察兔骨髓间充质干细胞诱导前后细胞间隙连接的功能变化。 结果与结论：正常组骨髓间充质干细胞缝隙连接蛋白43呈弱表达，5-氮胞苷诱导2，4周后缝隙连接蛋白43的表达均显著增加(P < 0.01)，细胞间隙连接通讯功能明显增强(P < 0.001)，且随诱导时间的延长呈依赖性增强(P < 0.05)。骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养后，诱导组缝隙连接蛋白43明显呈线状表达在两个相邻细胞的接触面。与诱导4周时比较，阻滞剂组细胞间隙连接通讯功能明显受到抑制(P < 0.001)。提示骨髓间充质干细胞能够自发表达缝隙连接蛋白43，在移植后早期能与心肌细胞形成间隙连接，从而有利于移植后心肌电传导，并发挥骨髓间充质干细胞的旁分泌效应。
中图分类号:
.jpg)
3.2 BMSCs形成间隙连接及功能的变化 罗氏黄荧光染料的划痕试验中，发现未诱导的BMSCs即具备间隙连接通讯功能，荧光染料通过划痕处细胞破口渗透入细胞后，在细胞间形成的间隙连接扩散到相邻细胞，而朝心肌细胞分化的BMSCs的细胞间隙连接通讯功能明显增强，这与缝隙连接蛋白43表达增强的结果相一致。实验使用特异性细胞间隙连接阻滞剂甘草次酸阻断细胞间隙连接通讯功能后，罗氏黄基本不能再扩散，而仅局限于划痕旁的细胞，从侧面说明BMSCs形成了间隙连接通讯功能。2005年Beeres等[16]体外培养实验显示，人BMSCs能修复心肌传导阻滞，可能与人BMSCs和心肌细胞间形成缝隙连接蛋白相关。
3.3 BMSCs移植致心律失常的潜在风险 近期有人提出BMSCs与心肌细胞在体外共培养时，由于膜电位及电冲动传导速度的差异，可能在细胞间形成折返，而形成潜在致心律失常的风险[17-18]。课题组认为可能是早期BMSCs的缝隙连接蛋白43表达尚不完全，并且所形成的间隙连接通讯功能数量和功能尚不完善有关，但随着BMSCs分化为心肌细胞，这种细胞电位差异的消除和间隙连接通讯功能的完善，其诱发心律失常的潜在危险可能被消除。BMSCs移植到心肌后，早期发生心律失常的原因也可能是注射过程心肌组织受损出血或组织水肿而导致，而非细胞所诱发。在其他一些动物实验甚至临床人体实验中，并没有观察到BMSCs明显的致严重室性心律失常的事件发生[19]，提示BMSCs用于心脏移植具有较大的安全性。早期骨骼肌成肌细胞移植到心脏后，发现能改善心功能，同时心律失常的概率明显提高，认为与骨骼肌成肌细胞不表达缝隙连接蛋白43，无法与心肌细胞产生间隙连接，形成细胞孤岛，从而影响心脏电活动稳定。有文献将缝隙连接蛋白43基因载入骨骼肌成肌细胞，使其表达缝隙连接蛋白43，再移植后发现室性心律失常发生率下降，也证明了缝隙连接蛋白43在心肌细胞间电活动传导与协调一致运动的重要性[20]。目前BMSCs的移植有两种选择，一种是在体外诱导分化后再移植到体内，另一种是直接移植，利用心肌微环境刺激使BMSCs分化为心肌细胞。从实验结果看，移植诱导分化后的细胞可能更有利于心肌整体的电活动稳定[21]。
结论：①BMSCs能够作为心脏细胞移植的理想细胞，优势有易于取得、不存在法律及伦理问题。②在分化为心肌细胞同时，能与心肌细胞在移植早期即形成间隙连接，保证了心肌细胞电活动的稳定。③分化为心肌细胞后，缝隙连接蛋白43表达与功能增强，从而改善心肌传导功能[19，21]。上述特点将有利推动骨髓间充质干细胞在心肌移植的进一步研究。