聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜联合间充质干细胞修复子宫内膜损伤

doi:10.12307/2025.429

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (16): 3369-3379.doi: 10.12307/2025.429

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聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜联合间充质干细胞修复子宫内膜损伤

安江茹1，张锦艺1，王秋花1，杨杨杨1，王文双2，张晓晴1

滨州医学院基础医学院，人体解剖与组织胚胎学教研室，生物材料与组织再生国际合作联合实验室，山东省烟台市 264003；2烟台毓璜顶医院妇科，山东省烟台市 264000

收稿日期:2024-02-28 接受日期:2024-04-23 出版日期:2025-06-08 发布日期:2024-09-03
通讯作者: 张晓晴，教授，滨州医学院基础医学院，人体解剖与组织胚胎学教研室，生物材料与组织再生国际合作联合实验室，山东省烟台市 264000 王文双，主任医师，烟台毓璜顶医院妇科，山东省烟台市 264000
作者简介:安江茹，女，1999年生，河南省濮阳市人，汉族，硕士，主要从事生物材料与组织再生研究。
基金资助:
山东省自然科学基金-青年基金项目(ZR2021QC034)，项目负责人：张晓晴；泰山学者青年项目(tsqn202103111)，项目负责人：张晓晴

Mesenchymal stem cells combined with polycaprolactone-hyaluronic acid electrospinning membrane in repair of endometrial injury

An Jiangru1, Zhang Jinyi1, Wang Qiuhua1, Yang Yangyang1, Wang Wenshuang2, Zhang Xiaoqing1

1School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical University, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Joint Laboratory for International Cooperation in Biomaterials and Tissue Regeneration, Yantai 264003, Shandong Province, China; 2Department of Gynecology, Yantai Yuhuanding Hospital, Yantai 264000, Shandong Province, China

Received:2024-02-28 Accepted:2024-04-23 Online:2025-06-08 Published:2024-09-03
Contact: Corresponding author: Zhang Xiaoqing, Professor, School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical University, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Joint Laboratory for International Cooperation in Biomaterials and Tissue Regeneration, Yantai 264003, Shandong Province, China Corresponding author: Wang Wenshuang, Chief physician, Department of Gynecology, Yantai Yuhuanding Hospital, Yantai 264000, Shandong Province, China
About author:An Jiangru, Master, School of Basic Medical Sciences, Binzhou Medical University, Department of Human Anatomy and Histoembryology, Joint Laboratory for International Cooperation in Biomaterials and Tissue Regeneration, Yantai 264003, Shandong Province, China
Supported by:
Shandong Provincial Natural Science Foundation-Youth Fund Project, No. ZR2021QC034 (to ZXQ); Mount Taishan Scholar Youth Project, No. tsqn202103111 (to ZXQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
静电纺丝：是利用高压静电场对高分子溶液的击穿作用来制备纳微米纤维材料的方法，基本原理是在喷射装置和接收装置间施加上万伏的静电场，从纺丝液的锥体端部形成射流并在电场中被拉伸，最终在接收装置上形成无纺状态的纳米纤维。
人子宫内膜间充质干细胞：是一种具有多向分化潜能、自我更新能力、低免疫原性、低致瘤性等特性的成体干细胞，能够直接修复受损的子宫内膜，促进血管生成，恢复子宫形态结构。
背景：人子宫内膜间充质干细胞能够直接修复受损的子宫内膜，促进血管生成、恢复子宫形态结构，然而将干细胞直接注入受损子宫内膜后的细胞存活率低、滞留时间短，修复效果有限。
目的：观察聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜复合人子宫内膜间充质干细胞修复大鼠子宫内膜损伤的效果。
方法：①细胞实验：采用胶原酶消化法提取人子宫内膜间充质干细胞，静电纺丝技术制备聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜。将人子宫内膜间充质干细胞分别接种于聚苯乙烯培养板与聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜上，通过DNA定量分析、WST-1细胞活性实验、鬼笔环肽染色、扫描电镜观察细胞的增殖与黏附能力，qRT-PCR检测静电纺丝膜上细胞CD90、Meflin的mRNA表达。②动物实验：取27只处于动情期的雌性SD大鼠，通过机械搔刮法建立宫腔粘连模型后随机分为3组，每组9只：空白对照组不进行任何治疗，对照组将聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜植入宫腔损伤部位，实验组将聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜/人子宫内膜间充质干细胞补片植入宫腔损伤部位。术后第3，7，14天取材，采用苏木精-伊红染色观察子宫形态结构及腺体数量，qRT-PCR和免疫荧光染色观察子宫组织CD31、血管内皮生长因子的表达。
结果与结论：①细胞实验：与聚苯乙烯培养板相比，聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜可促进人子宫内膜间充质干细胞的增殖与黏附，并且聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜支持人子宫内膜间充质干细胞基因CD90和Meflin的表达；②动物实验：苏木精-伊红染色显示，聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜/人子宫内膜间充质干细胞补片可促进子宫内膜损伤后形态结构的恢复，术后第14天的内膜厚度与腺体数量均多于空白对照组、对照组(P < 0.05)；qRT-PCR和免疫荧光染色检测显示，实验组术后第7，14天的CD31、血管内皮生长因子mRNA与蛋白表达均高于空白对照组、对照组(P < 0.05)；③结果表明：聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜可以提高干细胞的存活率、延长干细胞与受损组织的接触时间，二者复合移植可更好地修复受损子宫内膜组织。
https://orcid.org/0009-0004-4635-1495 (安江茹)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 子宫内膜, 宫腔粘连, 人子宫内膜间充质干细胞, 静电纺丝膜, 聚己内酯, 透明质酸

Abstract: BACKGROUND: Human endometrial mesenchymal stem cells can directly repair the damaged endometrium, promote angiogenesis, and restore the morphological structure of the uterus. However, after the direct injection of stem cells into the damaged endometrium, the cell survival rate is low, the retention time is short, and the repair effect is limited.
OBJECTIVE: To observe the effect of polycaprolactone-hyaluronic acid electrospinning membrane combined with human endometrial mesenchymal stem cells on endometrial injury in rats.
METHODS: (1) Cell experiment: Human endometrial mesenchymal stem cells were extracted by collagenase digestion method. Polycaprolactone-hyaluronic acid electrospinning membrane was prepared by electrospinning technology. The human endometrial mesenchymal stem cells were inoculated on polystyrene culture plate and polycaprolactone-hyaluronic acid electrospinning membrane. The proliferation and adhesion of the cells were observed by DNA quantitative analysis, WST-1 cell activity test, phalloidin staining, and scanning electron microscopy. The mRNA expressions of CD90 and Meflin in electrospun membrane were detected by qRT-PCR. (2) Animal experiments: 27 female SD rats in estrus were selected to establish uterine adhesion model by mechanical scratching method and randomly divided into three groups with nine rats in each group: The blank control group did not receive any treatment; the control group was implanted with polycaprolacton-hyaluronic acid electrospinning membrane; the experimental group was implanted with polycaprolacton-hyaluronic acid electrospinning membrane/human endometrial mesenchymal stem cell mesh. Samples were collected at 3, 7, and 14 days after surgery. Hematoxylin-eosin staining was used to observe the morphological structure of uterus and the number of glands. qRT-PCR and immunofluorescence staining were used to observe the expression of CD31 and vascular endothelial growth factor in uterine tissue.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cell experiment: Compared with polystyrene culture plate, polycaprolactone-hyaluronic acid electrospinning membrane could promote the proliferation and adhesion of human endometrial mesenchymal stem cells. Polycaprolactone-hyaluronic acid electrospinning membrane supported the expression of CD90 and Meflin genes of human endometrial mesenchymal stem cells. (2) Animal experiments: Hematoxylin-eosin staining showed that polycaprolactic-hyaluronic acid electrospinning membrane/human endometrial mesenchymal stem cell patch could promote the recovery of endometrial morphological structure after injury. The endometrial thickness and number of gland on day 14 after surgery were higher than those in blank control group and control group (P < 0.05). qRT-PCR and immunofluorescence staining showed that the mRNA and protein expressions of CD31 and vascular endothelial growth factor in the experimental group were higher than those in the blank control group and the control group at 7 and 14 days after surgery (P < 0.05). (3) The results showed that polycaprolacton-hyaluronic acid electrospinning membrane could improve the survival rate of stem cells and prolong the contact time between stem cells and the damaged tissue, and the composite transplantation of the two could better repair the damaged endometrial tissue.

Key words: endometrium, intrauterine adhesion, human endometrial mesenchymal stem cell, electrospinning membrane, polycaprolactone, hyaluronic acid

中图分类号:

安江茹, 张锦艺, 王秋花, 杨杨杨, 王文双, 张晓晴. 聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜联合间充质干细胞修复子宫内膜损伤[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(16): 3369-3379.

An Jiangru, Zhang Jinyi, Wang Qiuhua, Yang Yangyang, Wang Wenshuang, Zhang Xiaoqing. Mesenchymal stem cells combined with polycaprolactone-hyaluronic acid electrospinning membrane in repair of endometrial injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(16): 3369-3379.

图/表（结果） 10

2.1 hEMSCs的鉴定
细胞形态观察：倒置显微镜可见hEMSCs表现出贴壁特性，细胞狭长，呈纺锤状结构，螺旋形生长，见图1。

流式细胞术检测结果：细胞表面标志物CD90和CD73呈高表达，阳性表达率分别为(96.5±0.4)%，(99.7±0.3)%；CD45呈低表达，阳性表达率为(1.5±0.1)%，见图2。

成脂、成骨、成软骨分化：hEMSCs成脂诱导分化21 d后，油红O染色后显微镜下可见透明圆形亮点，为脂滴，见图3A；成骨诱导分化21 d后，茜素红染色后显微镜下可见细胞呈堆叠生长，形成明显的矿化结节，见图3B；成软骨诱导分化21 d后，阿利新蓝染色后显微镜下可见细胞形态改变，呈多角形，并分泌糖胺聚糖，见图3C。

2.2 细胞实验结果
2.2.1 hEMSCs在PCL-HA静电纺丝膜上的增殖和代谢活性通过DNA定量分析和WST-1细胞活性实验研究PCL-HA静电纺丝膜对hEMSCs增殖和代谢活性的影响，结果显示：培养第3，7天，与聚苯乙烯培养板相比，PCL-HA静电纺丝膜上的hEMSCs显示出更高的增殖能力，并且随着培养时间的延长，PCL-HA静电纺丝膜上的细胞数目增加，见图4A；培养第7天，与聚苯乙烯培养板相比，PCL-HA静电纺丝膜上的hEMSCs具有更高的代谢活性，并且随着培养时间的延长，PCL-HA静电纺丝膜的上细胞代谢活性增强，见图4B。

2.2.2 hEMSCs在PCL-HA静电纺丝膜材料上的黏附、排列与增殖鬼笔环肽染色结果显示hEMSCs在PCL-HA静电纺丝膜上可以较好地黏附和生长，细胞沿着静电纺丝纤维呈现平行排列，而聚苯乙烯培养板上的hEMSCs呈随机方向分布，见图5A。随着时间的推移，相对于聚苯乙烯培养板，PCL-HA静电纺丝膜上的hEMSCs黏附面积与细胞数目均明显增加，见图5B，C。扫描电镜下可见PCL-HA静电纺丝膜具有定向排列的超细纤维及超高孔隙率，随着培养时间的推移，生长在PCL-HA静电纺丝膜上的hEMSCs黏附面积明显增加，见图6。

2.2.3 hEMSCs在PCL-HA静电纺丝膜材料上的间充质干细胞表型维持 qRT-PCR检测结果显示，hEMSCs接种在PCL-HA静电纺丝膜第1，3，7天后，hEMSCs间充质干细胞标记物CD90、Meflin的表达无差异(P > 0.05)，表明PCL-HA静电纺丝膜在培养过程中能够维持hEMSCs的间充质干细胞表型，见图7。

2.3 动物实验结果
2.3.1 实验动物数量分析 27只大鼠全部进入结果分析。
2.3.2 PCL-HA/hEMSCs移植修复宫腔粘连大鼠子宫形态结构苏木精-伊红染色结果见图8，结果显示空白对照组大鼠子宫内膜发育不良，内膜厚度变薄，腺体数量减少，术后第3，7，14天的子宫内膜厚度和腺体数量比较差异无显著性意义(P > 0.05)；术后第7天，相比较于空白对照组和对照组，实验组大鼠子宫内膜厚度明显增加，腺体数量未见明显增加；术后第14天，对照组和实验组大鼠宫腔内仍存在未降解的静电纺丝膜材料，实验组子宫内膜与腺体数目均多于其他两组，证明PCL-HA/hEMSCs补片中的hEMSCs在大鼠子宫内膜中持续发挥作用。这提示PCL-HA/hEMSCs补片能持续在大鼠宫腔内定植，并且hEMSCs持续发挥作用并促进损伤子宫内膜形态结构的修复。

2.3.3 PCL-HA/hEMSCs移植促进宫腔粘连大鼠子宫内膜血管生长 CD31存在于内皮细胞间紧密连接处，是血管内皮细胞的标志物。血管内皮生长因子是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，可以促进血管通透性增加、血管内皮细胞增殖和血管形成。qRT-PCR 检测与免疫荧光染色结果显示，实验组术后第7，14天的CD31表达高于空白对照组、对照组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，术后第3，7，14天的血管内皮生长因子表达高于空白对照组、对照组(P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001)，见图9，10。

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引言

人子宫内膜是一种高度动态的可再生组织，在女性整个育龄期中经历了400多次脱落和再生[1]。位于宫腔表面的子宫内膜可分为基底层和功能层两部分，在胚胎着床和妊娠维持中发挥显著作用[2]。自青春期起，在卵巢分泌雌激素和孕激素的周期性作用下，正常子宫内膜功能层出现周期性变化，称为月经周期。子宫内膜周期性变化一般分为3期，即月经期、增生期和分泌期。反复诊断性刮宫、流产或感染通常会造成子宫内膜损伤，从而导致宫腔粘连，影响生育[3-4]。宫腔粘连的主要临床症状包括周期性下腹痛、月经量减少、复发性流产和不孕症[5]，目前传统的治疗方法有宫腔镜下经宫颈粘连切除术、应用人工激素治疗、宫内放置节育器等，但是治疗后的子宫内膜仍有损伤，无法避免粘连重新形成[6]。因此，迫切需要研究出有效、稳定的宫腔粘连防治方法。研究表明，人子宫内膜间充质干细胞(human endometrial mesenchymal stem cells，hEMSCs)具有自我更新和组织再生的能力，能够直接修复受损的子宫内膜，促进血管生成，恢复子宫形态结构[7-9]；此外，hEMSCs具有高增殖活性、长期稳定性和低免疫原性，而且获得方式较为容易，无伦理学困扰，在组织损伤修复的临床应用中有巨大应用前景[10]。然而既往研究发现，直接将干细胞注射到受损子宫内膜中的修复效果有限，因为移植后的干细胞在受损组织中的存活率低，免疫排斥、损伤组织炎症、氧化应激环境等不良因素均可干扰移植干细胞在损伤组织中的存活[11]。生物材料可以支持干细胞的附着和增殖，延长干细胞与损伤组织的接触时间，从而达到更好的修复效果[12]。
静电纺丝技术已成为制备携带干细胞纳米纤维材料的主流方法，这些纳米材料可用于制备组织修复和伤口愈合的组织补片[13]。静电纺丝膜与天然细胞外基质在形态上具有相似性，其特征是超细连续纤维、高表面体积比、高孔隙率和可变孔径分布[14]，这种支架结构决定了细胞的附着、迁移、增殖和分化[15]。聚己内酯是一种医疗常用的有机聚合物，机械性能强、生物相容性好，可以降解，然而其疏水性可能会限制细胞的黏附和增殖[16]。透明质酸是一种源自天然细胞外基质的线形多糖[17]，具有极佳的亲水性、生物相容性、生物可降解性和非免疫反应性，参与调控细胞的黏附、增殖、分化等多种细胞生理过程[18]，近年来成为天然生物医用材料的研究热点[19]。研究发现，透明质酸可作为机械和物理屏障减少子宫毛细血管出血，改善宫内环境，防止宫腔粘连术后复发[20]，然而透明质酸会迅速流出子宫腔，不能长时间形成屏障，限制了治疗效果[21]。因此，可以利用静电纺丝技术将具有强大机械性能的合成生物材料聚己内酯和天然生物材料透明质酸结合，生成复合功能纳米纤维膜，利用透明质酸特殊的物理性质和促进细胞迁移的生理功能来改善纳米纤维的局限性，同时结合聚己内酯优秀的力学性质与稳定性来增加透明质酸的可纺性。此次实验将hEMSCs种植在聚己内酯-透明质酸(polycaprolactone-hyaluronic acid，PCL-HA)静电纺丝膜上形成细胞-材料补片，延长干细胞在组织损伤部位发挥作用的时间，观察补片促进受损子宫内膜组织修复和再生的效果。
血管生成对于子宫内膜健康状态非常重要，良好的血供可以更好地帮助内膜修复[22]。血管生成为胚胎滋养细胞侵入位于底蜕膜的子宫螺旋动脉、形成毛细血管网提供基础，并且提高子宫内膜的容受性，促进胚胎的着床和发育，在胚胎植入后维持妊娠状态[23]。血管生成的动态平衡受到促血管生成因子的调节控制，血管内皮生长因子可能是血管发育过程中最特异和最关键的因子[24]。血管内皮生长因子是一种特异性有丝分裂原，对血管内皮细胞有生长刺激和趋化作用，促进新血管形成、维持血管壁的完整性和通透性，参与受精着床、胎盘形成和胎儿生长发育等重要过程[25-27]。基质微血管密度是评价血管生成的客观指标，CD31具有特异性，是内皮细胞的敏感标志物，可以用来标记微血管密度[28]。
实验将从人子宫内膜组织中分离hEMSCs，评估PCL-HA静电纺丝膜对hEMSCs增殖、黏附及间充质干细胞基因表达的影响，进一步将PCL-HA静电纺丝膜复合hEMSCs移植到受损的子宫内膜中，明确PCL-HA静电纺丝膜复合hEMSCs是否可以恢复大鼠子宫内膜的形态结构以及促进血管生成，为宫腔粘连治疗提供新的方法和策略。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞实验+动物实验，两组间的数据分析比较采用两独立样本t检验，多组间的数据比较分析采用单因素方差分析和Turkey’s多重比较检验方法。
1.2 时间及地点实验于2021年7月至2023年7月在滨州医学院解剖学教研室-生物材料与组织再生实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康雌性SD大鼠27只，8-10 周龄，体质量220-250 g，均购自济南朋悦生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(鲁)2022-0006。实验大鼠饲养于山东省滨州医学院烟台校区清洁级动物房，条件为光照时间12 h/d，温度22 ℃，相对湿度50%，鼠粮和水提供充足，保证定时更换垫料并通风换气，实验条件符合SPF级动物实验室的标准，实验开始前适应性喂养1周。动物实验已通过滨州医学院伦理委员会审核批准(伦理审批号：动研批第2021-068号)。
1.3.2 实验材料与试剂聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜(纤维膜直径为780 nm，孔隙率为82%，厚度为34 μm，西安昊然)；DMEM/F12培养基、青霉素-链霉素混合液、胎牛血清、成脂分化诱导试剂盒、成骨分化诱导试剂盒、成软骨分化诱导试剂盒(武汉普诺赛)；0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、油红O染色液、茜素红染色液、阿利新蓝染色液、结晶紫染色液、罗丹明标记鬼笔环肽、DAPI溶液、抗荧光衰减封固剂、2.5%戊二醛固定液、中性树胶、封闭山羊血清(北京索莱宝)；胶原酶Ⅰ型、40 g/L多聚甲醛(中国白鲨)；CD90-PE流式抗体、CD73-PE-cy7流式抗体、CD45-APC-cy7流式抗体(美国BioLegend)；WST-1试剂盒(上海碧云天)；Triton/EDTA细胞裂解液(北京索莱宝)；Hoechst 33258染色液(北京索莱宝)；DNA标准溶液(美国Sigma)；Trizol、反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒(南京诺唯赞)；引物(湖南艾科瑞)；苏木精、伊红(上海诺伦)；CD31兔一抗(武汉三鹰)；血管内皮生长因子兔一抗(武汉博士德)；山羊抗兔IgG免疫荧光二抗(美国Immunoway)。
1.3.3 实验仪器恒温水浴锅(上海力辰邦西)；恒温振荡器(上海一恒)；CO2培养箱(上海力新)；离心机(长沙湘仪)；荧光倒置显微镜(美国Echo)；酶标仪(上海美谷)；石蜡包埋机、石蜡切片机(德国Leica)；冰冻切片机(美国Thermo Fisher)；超纯水过滤机(四川优普)；流式细胞仪(美国BD)；扫描电镜(德国蔡司)；实时荧光定量仪(德国罗氏)。
1.4 方法
1.4.1 hEMSCs的提取及培养[29] 人子宫内膜组织从烟台毓璜顶医院获取，供者对实验知情同意并签署了知情同意书，实验已通过滨州医学院伦理委员会批准(伦理审批号：伦研批第2021-043号)。

提前准备离心管，加入含1%青霉素-链霉素混合液的PBS，收集人体子宫内膜组织标本，0 ℃低温下运输。用含1%青霉素-链霉素混合液的PBS将子宫内膜组织冲洗3次，清除表面的血液和黏液。用无菌眼科剪将组织剪成糊状，转移到离心管，加入组织二三倍体积的Ⅰ型胶原酶(1 mg/mL)，置于37 ℃恒温振荡器中80 r/min消化60 min。消化过后再加入等体积的DMEM/F12完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液)终止消化。经40 μm筛网过滤后收集滤液到离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用DMEM/F12完全培养基重悬细胞沉淀后接种于培养瓶中，得到原代hEMSCs。原代细胞培养24 h后首次换液，以后每2 d换液1次。观察细胞融合至80%-90%后用胰酶消化，以1∶2比例传代，每隔3 d传代1次，取第4代细胞做后续实验。

1.4.2 hEMSCs的鉴定
细胞形态观察：使用倒置显微镜观察hEMSCs的形态并拍摄照片。
流式细胞术检测细胞表面抗原：取第4代hEMSCs，弃培养基，用PBS清洗，胰酶消化5 min后加入DMEM/F12完全培养基终止消化，1 500 r/min离心10 min，收集细胞沉淀，计数后用无菌PBS重悬。取50 μL细胞悬液至流式管，分别加入CD90-PE、CD73-PE-cy7和CD45-APC-cy7
抗体4 ℃避光孵育40 min，用PBS清洗后上流式细胞仪检测。
成脂、成骨、成软骨诱导分化：将hEMSCs接种于96孔板，观察细胞融合至80%后，按照试剂盒说明书分别加入成脂、成骨和成软骨诱导培养基，每2 d换液一次。诱导21 d后，分别进行油红O、茜素红或阿利新蓝染色，显微镜下观察细胞分化情况并拍照。
1.4.3 PCL-HA静电纺丝膜的制备分别称取1.88 g的聚己内酯与0.94 g的透明质酸，一同加入到10 mL六氟异丙醇中磁力搅拌12 h，获得澄清透明的纺丝液。将纺丝液倒入注射器，在静电纺丝机上纺丝，设置纺丝液流速为1.5 mL/h，纺丝电压为12.6 kV，纺丝距离为20 cm。纺丝完成后，将纤维膜在真空干燥箱烘干48 h以去除残余溶剂，最后避光储存在干燥器中备用。使用前置于体积分数70%乙醇中消毒过夜。
1.4.4 细胞实验
实验分组及干预：用打孔器将PCL-HA静电纺丝膜做成大小均一的圆片，放入48孔板中，每孔加入体积分数70%乙醇消毒过夜，次日加入PBS漂洗3次，直至去除残留的乙醇。将hEMSCs悬浮液分别接种于聚苯乙烯培养板与PCL-HA静电纺丝膜上，细胞密度为5×104/孔，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。
DNA量化分析细胞增殖：培养1，3，7 d后，每孔加入50 μL 0.05%Triton/EDTA细胞裂解液，冰上裂解细胞1 h，将裂解液转移至1.5 mL离心管中剧烈振荡30 s，65 ℃水浴30 min(共2次)；4 ℃下15 000 r/min离心15 min，保留上清，获得样品本液。取96孔黑板，在标准孔和样品孔中分别加入100 μL Hoechst 33258染料溶液(1 mg/mL)，在标准孔中分别加入0，1，2，3，4，5 μL已知浓度的DNA标准溶液，在样品孔中加入10 μL样品溶液，避光反应5 min，使用酶标仪在激发波长为360 nm、发射波长为460 nm下进行读数。
WST-1法分析细胞活性：培养1，3，7 d后，将WST-1试剂和DMEM/F12完全培养基体积比1∶10混合后加入孔内，混合溶液体积200 μL，置于CO2培养箱中培养1 h，使用酶标仪在波长450 nm下测量吸光度值。
鬼笔环肽染色观察细胞黏附与增殖：培养1，3，7 d后，弃培养基，用PBS清洗，室温下用40 g/L多聚甲醛溶液固定10 min；用PBS清洗，加入0.5%TritonX-100溶液透化处理10 min；用PBS清洗，每孔加入200 μL鬼笔环肽工作液(2 μL鬼笔环肽储存液，198 μL PBS)覆盖细胞，室温下避光孵育30 min；用PBS清洗，每孔加入200 μL DAPI溶液室温下避光孵育1 min；用PBS清洗，滴加抗荧光淬灭封固剂封固，置于荧光显微镜下观察并拍照。使用Image J软件对荧光面积进行测定分析，每张荧光切片随机选取4个高倍镜视野计数细胞，取平均值。
扫描电镜观察细胞黏附：培养1，3，7 d后，取出细胞-材料复合物，用PBS轻轻冲洗，2.5%戊二醛在4 ℃下固定过夜，梯度浓度乙醇脱水，样品干燥后表面喷金，置于扫描电镜下观察并拍摄照片。
qRT-PCR检测：培养1，3，7 d后，采用Trizol法提取静电纺丝膜上细胞(或动物实验术后第3，7，14天的子宫内膜组织)mRNA，然后按照反转录试剂盒说明书在冰上进行cDNA合成。将获得的cDNA样品用RNase-free ddH2O稀释10倍，用于qRT-PCR。反应体系：10 μL 2×ChamQ SYBR qRT-PCR Master Mix、0.4 μL正向引物(10 μmol/L)、0.4 μL反向引物(10 μmol/L)、0.7 μL cDNA、8.5 μL ddH2O。引物序列见表1。qRT-PCR条件：预变性(95 ℃ 30 s)；40个循环(95 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s)；熔解曲线(95℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s)。计算基因的相对表达量，采用 2-ΔΔCt方法对数据进行分析。细胞实验检测CD90、Meflin mRNA表达，动物实验检测血管内皮生长因子、CD31 mRNA表达。

1.4.5 动物实验将PCL-HA静电纺丝膜裁剪成2.5 cm×0.5 cm大小，置于体积分数70%乙醇中消毒过夜。将50 μL hEMSCs悬液滴于PCL-HA静电纺丝膜上(细胞数量1×106)，置于CO2培养箱中37 ℃孵育24 h后使用。

宫腔粘连动物模型的建立与分组干预：实验大鼠术前禁食、禁饮12 h。取处于动情期的雌性SD大鼠27只，腹腔注射1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉处理，在腹部距离尿道口约3 cm处作纵行切口，进入腹腔，找出“Y”形子宫，在子宫分叉附近做小切口，插入改良的16 G注射器针头，以不刮破子宫壁为标准反复进行宫腔搔刮操作，直至子宫体有明显充血反应及感觉子宫壁变得粗糙时停止刮宫。刮宫完成后，采用随机数字表法将大鼠分为3组，每组9只：空白对照组不进行任何治疗，逐层关闭大鼠腹腔；对照组用针头辅助将裁剪好的无菌PCL-HA静电纺丝膜移植到受损子宫内膜表面，逐层关闭大鼠腹腔；实验组用针头辅助将PCL-HA静电纺丝膜/hEMSCs补片移植到受损子宫内膜表面，逐层关闭大鼠腹腔。

苏木精-伊红染色观察子宫形态结构：术后第3，7，14天，每组每个时间点各取大鼠3只，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后取子宫内膜组织，置于40 g/L多聚甲醛固定48 h，放入包埋盒内，流水冲洗过夜。将子宫组织依次浸入体积分数75%，85%，95%乙醇各2 h，体积分数100%乙醇Ⅰ和Ⅱ各30 min，二甲苯Ⅰ和Ⅱ各30 min，浸蜡2 h后包埋，调整切片机厚度为4 μm进行切片，60 ℃烤箱烤片3 h。将石蜡切片依次浸入二甲苯Ⅰ和Ⅱ各15 min，体积分数100%乙醇Ⅰ和Ⅱ各10 min，体积分数95%，85%，75%乙醇各5 min，蒸馏水1 min，然后进行苏木精-伊红染色，体积分数75%，85%，95%，100%乙醇脱水各5 min，二甲苯Ⅰ和Ⅱ各处理5 min，中性树胶封固。每张切片在低倍镜视野下拍照，每张切片视野选取相互垂直4处，使用Image J软件测量内膜厚度，取平均值；每张切片随机选择4个高倍镜视野，计数腺体数量，取平均值。
免疫荧光染色检测CD31、血管内皮生长因子蛋白表达：术后第3，7，14天，取子宫内膜组织，置于40 g/L多聚甲醛中固定至少24 h，放入30%蔗糖溶液中直至组织沉糖；OCT包埋后，冷冻切片机切片(10 μm)，用PBS清洗；滴加0.5%TritonX-100溶液破膜10 min，用PBS清洗；滴加山羊血清封闭液室温封闭1 h，滴加PBS稀释的CD31、血管内皮生长因子一抗(均1∶200稀释)4 ℃避光过夜，用PBS清洗；滴加与一抗同种属的荧光二抗(1∶500稀释)室温避光反应2 h，用PBS清洗；滴加DAPI染色液室温避光反应5 min，用PBS清洗；滴加抗荧光衰减封固剂封固，倒置荧光显微镜下观察并拍照。使用Image J软件对阳性表达荧光面积进行测定分析，每张荧光切片随机选取4个高倍镜视野，取平均值。
qRT-PCR检测：取术后第3，7，14天的子宫内膜组织，采用qRT-PCR检测血管内皮生长因子、CD31 mRNA表达。检测方法同上。
1.5 主要观察指标 PCL-HA静电纺丝膜对hEMSCs增殖、黏附及间充质干细胞基因表达的影响，以及PCL-HA静电纺丝膜/hEMSCs补片修复大鼠受损子宫内膜的效果。
1.6 统计学分析所有数据均经过3次独立重复实验，使用 IBM SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，以x±s表示。两组间的数据分析比较采用两独立样本t检验，多组间的数据比较分析采用单因素方差分析和Turkey’s多重比较检验方法。P < 0.05表示数据差异有显著性意义，P < 0.01表示数据差异有非常显著性意义。该文统计学方法已经滨州医学院生物统计学专家审核。

讨论

子宫内膜在人类月经周期中经历复杂的再生和分化，在女性未怀孕时形成月经，在怀孕时为胚胎的生长发育提供充足的营养[30]。子宫内膜是成功着床、胎盘形成及胎儿生长和存活直至出生的唯一部位，对人类的生殖至关重要[31]。健康的子宫内膜是实现人类生殖及支持母婴健康的先决条件，反复流产、终止妊娠、反复诊断刮宫术和宫内感染均可导致不可逆的子宫内膜受损，从而造成宫腔闭塞，是女性不孕症的重要原因之一[32]。目前传统的临床手段治疗效果有限，不能解决重症患者子宫内膜再生的难题。由于间充质干细胞在免疫调节和组织再生治疗方面具有巨大潜力，近年来在全球范围内备受瞩目。研究发现间充质干细胞能够迁移到组织受损的区域，分泌抗炎细胞因子，重建或促进伤口愈合[33-35]。hEMSCs是一种具有自我更新能力、高度分化潜力、较低免疫原性和低致瘤性的成体干细胞，以其为基础的治疗方法在宫腔粘连中取得了一些有前景的成果。既往研究表明，向大鼠子宫内膜损伤处注射hEMSCs后子宫内膜微血管比例增加、子宫内膜厚度增加、腺体形成增加，大鼠生育能力提高，促进了子宫内膜的再生[36-37]。在卵巢分泌雌激素和孕激素的作用下，子宫内膜每28 d左右发生一次周期性内膜脱落和再生，子宫内膜具有强大的再生能力，其本身被认为是干细胞的极佳来源，在生殖系统疾病治疗方面具有巨大前景[38]。此次实验结果表明，hEMSCs呈典型的长梭形间充质干细胞形态，高表达间充质干细胞标志物CD90和CD73，不表达CD45，并且具有较强的三系分化(成脂、成骨和成软骨)潜能，这些发现满足了国际细胞治疗学会间充质和组织干细胞协会提出的定义人类间充质干细胞的最低标准[39-40]。hEMSCs可以很容易地从组织中分离，不会给患者带来不便，这对于在临床实践中实施基于干细胞的治疗具有重要价值。
值得注意的是，传统干细胞的移植治疗效果受到干细胞存活率较低的限制，静脉注射间充质干细胞进入血液循环后被巨噬细胞大量吞噬，归巢至损伤部位的间充质干细胞数量明显减少；同时，由于液体的流动性，局部宫腔灌注的间充质干细胞也难以长时间存活[41-42]。因此，提高细胞活力和利用率是增强间充质干细胞修复功能的关键。既往研究表明，生物材料支架可以为受损组织的修复提供结构和机械支持，模拟自然环境，促进营养物质的运输和干细胞的募集、黏附、增殖和分化[43]。目前在宫腔粘连术后可以使用抗粘连材料，如透明质酸凝胶，在一定程度上可以防止粘连的再次发生，以促进子宫内膜增殖与血管生成[20]。既往研究表明，透明质酸联合间充质干细胞可以治疗大鼠子宫内膜损伤，增加子宫内膜厚度，提高腺体数量，修复受损的子宫内膜。然而透明质酸在宫腔内的滞留时间较短，显著限制了间充质干细胞联合透明质酸支架修复受损子宫内膜的潜力[44]。静电纺丝是一种易于操作和经济有效的构建组织工程支架方法，其制备的静电纺丝膜具有较高的比表面积、孔隙率和可控的形态尺寸，可以促进细胞的黏附和增殖[45]。此次实验制备了PCL-HA静电纺丝膜，进一步将hEMSCs种植在PCL-HA静电纺丝膜上，以提高移植hEMSCs的活性，延长hEMSCs与受损子宫内膜损伤部位的接触时间，使其具有更好的修复潜力。
此次实验探讨了PCL-HA静电纺丝膜对hEMSCs黏附、增殖、间充质干细胞基因表达的影响。DNA量化分析和WST-1细胞活性测试实验结果表明，种植在PCL-HA静电纺丝膜上的hEMSCs增殖能力和细胞活性都显著增强，这可能与PCL-HA静电纺丝膜的材料结构和性能相关：与聚苯乙烯培养板简单的2D平面不同，PCL-HA静电纺丝膜为3D网状结构，与天然细胞外基质在形态上具有相似性，具有超细连续纤维、高表面体积比和高孔隙率，可以促进细胞的增殖和活性[14-15]；此外，PCL-HA静电纺丝膜中的透明质酸是细胞外基质的主要多糖成分，具有调节和增强干细胞再生特性的作用[46]。鬼笔环肽染色和扫描电镜实验结果进一步证实了这一结论，随着时间的推移，生长在PCL-HA静电纺丝膜上的hEMSCs细胞数量和黏附面积明显增加。hEMSCs在PCL-HA静电纺丝膜上可以沿着静电纺丝纤维呈现平行排列，而聚苯乙烯培养板上的hEMSCs呈随机方向分布，这可能与PCL-HA静电纺丝膜的表面形貌有关。扫描电镜下观察到与聚苯乙烯培养板的随机取向结构相比，PCL-HA静电纺丝膜纤维呈平行排列，对齐的纤维在一定程度上给予hEMSCs方向信号，hEMSCs在PCL-HA静电纺丝膜上可以沿着静电纺丝纤维呈现平行排列，这可能也与结构差异或细胞与基质黏附信号传导相关，进一步的具体机制有待研究。qRT-PCR检测显示PCL-HA静电纺丝膜支持hEMSCs间充质干细胞基因CD90和Meflin的表达，说明在培养过程中PCL-HA静电纺丝膜能够维持hEMSCs的间充质干细胞表型，推测与PCL-HA静电纺丝膜中的透明质酸成分具有一定联系。以上实验结果与LIU等[47]发现透明质酸通过调节Wnt/β-Catenin信号传导，以剂量依赖方式增强人间充质干细胞的增殖能力而不改变细胞表型的结果相一致。
较薄的子宫内膜显著降低胚胎的种植率，往往导致不良妊娠结局。研究表明，女性子宫内膜厚度小于6 mm时明显不利于成功妊娠，胚胎着床率低至29.43%[48]。正常子宫内膜含有丰富的腺体，子宫内膜腺体分泌的液体不但可以起到润滑、保护子宫的作用，而且可以维持受精卵的存活和正常胎盘的发育。当腺体发育被抑制时会影响受精卵着床，甚至出现不孕的情况[49]。苏木精-伊红染色结果显示，相比较于空白对照组和对照组，PCL-HA静电纺丝膜/hEMSCs移植后第7天的子宫内膜厚度明显增加，移植后第14天的子宫内膜厚度与腺体数量均明显增多；此外直到移植后第14天，对照组和实验组大鼠宫腔内仍存在未降解的支架，说明复合功能生物材料可以防止透明质酸迅速流出子宫腔，使其长时间形成屏障发挥治疗作用。血管形成为周期性子宫内膜再生、胚胎着床、妊娠建立与维持提供了重要的微环境基础[50]。子宫内膜蜕膜化始于子宫血管附近，在受孕过程中充足的血供有助于子宫内膜的充分发育，为胚胎提供良好的环境及足够的营养保障，是成功受孕和维持妊娠的关键影响因素[51]。CD31通常位于血管内皮细胞，既能维持内皮细胞连接完整性，又能在炎症形成后加速血管通透性屏障的恢复[52]。CD31主要用于证明内皮细胞组织的存在，用于评估组织血管生成[53]。子宫内膜是一种高度血管化及动态可循环再生的组织[54]。血管内皮生长因子是一种重要的促进血管生成的生长因子，它随月经周期发生相应变化，可以特异地作用于血管内皮细胞，促进细胞迁移、增加微血管的通透性等，有助于调节血管生成过程[55-57]。宫腔粘连患者子宫内膜的毛细血管壁较薄、密度较低，提示血管生成在子宫内膜修复中起着重要作用[58]。qRT-PCR检测和免疫荧光染色实验结果显示，相比较于空白对照组和对照组，实验组大鼠子宫组织CD31和血管内皮生长因子的表达水平明显升高，PCL-HA静电纺丝膜/hEMSCs移植通过分泌血管内皮生长因子来促进子宫内膜的血管生成。
综上，此次实验结果表明，PCL-HA静电纺丝膜可促进hEMSCs的黏附和增殖，可以用作促进细胞生长的生物材料补片；PCL-HA静电纺丝膜/hEMSCs移植不但可以修复宫腔粘连模型大鼠子宫形态结构，促进内膜增厚及腺体的生成，还可以提高血管内皮生长因子的表达水平，促进子宫内膜血管的生成，达到修复受损子宫内膜的目的，但其作用机制仍有待进一步研究。此外，后期研究可以通过延长实验周期，对大鼠宫腔粘连模型展开生育力评估实验，为此次实验制备的补片应用于临床提供更加全面的研究补充。
结论：PCL-HA静电纺丝膜支持hEMSCs更好的黏附、增殖以及间充质干细胞基因的表达，可以作为生物材料补片来修复受损组织；将hEMSCs种植在PCL-HA静电纺丝膜上移植到大鼠子宫内膜损伤部位，可以提高干细胞的存活率、延长干细胞与受损组织的接触时间，从而更好地促进子宫内膜增厚、腺体生成和血管生成，修复受损子宫内膜组织。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

聚己内酯-透明质酸静电纺丝膜联合间充质干细胞修复子宫内膜损伤

Mesenchymal stem cells combined with polycaprolactone-hyaluronic acid electrospinning membrane in repair of endometrial injury

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