机器学习识别激素性股骨头坏死中线粒体自噬诊断标志物及免疫浸润分析

doi:10.12307/2025.332

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (11): 2402-2410.doi: 10.12307/2025.332

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机器学习识别激素性股骨头坏死中线粒体自噬诊断标志物及免疫浸润分析

黄柯琪，陈跃平，陈尚桐，李加根

广西中医药大学附属瑞康医院，广西壮族自治区南宁市 530000

收稿日期:2024-03-14 接受日期:2024-05-06 出版日期:2025-04-18 发布日期:2024-08-13
通讯作者: 陈跃平，博士，主任医师，博士生导师，广西中医药大学附属瑞康医院创伤骨科与手外科，广西壮族自治区南宁市 530000
作者简介:黄柯琪，男，1998年生，广西壮族自治区河池市人，壮族，广西中医药大学在读硕士，主要从事脊柱、骨关节创伤性疾病的防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(81960803)，项目负责人：陈跃平；广西壮族自治区医疗卫生临床重点学科急诊医学科项目(项目文号：桂卫医发{2021}17号)，项目负责人：陈跃平；广西临床重点专科(创伤外科)建设项目(项目文号：桂卫医发{2021}8号)，项目负责人：陈跃平；桂派中医药传承创新团队项目(2022A004)，项目负责人：陈跃平

Machine learning identification of mitochondrial autophagy diagnostic biomarkers and immune infiltration analysis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

Huang Keqi, Chen Yueping, Chen Shangtong, Li Jiagen

Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2024-03-14 Accepted:2024-05-06 Online:2025-04-18 Published:2024-08-13
Contact: Chen Yueping, PhD, Chief physician, Doctoral supervisor, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Huang Keqi, Master candidate, Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 81960803 (to CYP); Guangxi Zhuang Autonomous Region Healthcare Clinical Key Discipline of Emergency Medicine Project, No. {2021}17 (to CYP); Guangxi Clinical Key Specialty (Trauma Surgery) Construction Project, No. {2021}8 (to CYP); Gui’s Traditional Chinese Medicine Heritage Innovation Team Project, No. 2022A004 (to CYP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
激素性股骨头坏死：是由长期服用糖皮质激素类药物导致的股骨头慢性缺血，引起骨组织结构疏松，进而发展至股骨头进行性塌陷和关节破坏。
线粒体自噬：是通过特异性清除细胞质中功能失调的线粒体，从而维持线粒体功能的完整性和细胞稳态的选择性自噬。在外界各种刺激的作用下会导致线粒体DNA突变逐渐累积，为了维持线粒体和细胞稳态，损伤的线粒体被特异性包裹进自噬体中并与溶酶体融合，从而完成溶酶体的降解，这个过程称为线粒体自噬。

背景：线粒体自噬和激素性股骨头坏死的发生、发展关系密切，但具体生物标志物及调控机制尚未明确。
目的：通过机器学习算法识别激素性股骨头坏死中线粒体自噬的关键标志物及免疫浸润分析。
方法：从GEO数据库下载股骨头坏死数据集GSE123568和GSE74089，分别作为训练集和验证集，在激素性股骨头坏死组和对照组之间选择差异表达基因，进行加权共表达分析。从MitoCarta 3.0数据库下载线粒体自噬相关基因，然后与差异基因和模块基因取交集。利用两种机器学习算法鉴定激素性股骨头坏死线粒体自噬关键基因，利用外部验证集进行验证。采用CIBERSORT和免疫浸润分析免疫细胞占比，单样本基因集富集分析线粒体自噬基因与免疫细胞的相关性分析。
结果与结论：①差异分析共获得1 163个差异基因，其中有663个上调基因和500个下调基因；加权共表达分析鉴定出4个相关模块，共1 412
个模块基因；②最终与线粒体自噬基因取交集初步筛选出39个交叉基因可能是疾病相关线粒体自噬基因；GO富集分析结果显示，生物过程主要涉及血红素代谢、线粒体运输、核苷酸双磷酸代谢和硫酯代谢过程，细胞组分主要涉及线粒体基质、线粒体外膜、细胞器外膜和线粒体内膜，分子功能主要涉及脂肪酸连接酶活性、铁-硫簇结合和辅酶A连接酶活性；KEGG富集分析结果共映射出6条通路，主要涉及脂肪酸降解、线粒体自噬、丁酸代谢、脂肪酸生物合成和辅因子生物合成；③经LASSO回归和随机森林算法分析最终得到4个核心基因(ALDH5A1、FBXL4、MCL1和STOM)，4个核心基因和诊断列线图外部验证集的受试者工作特征曲线均大于0.9；④激素性股骨头坏死发生发展与活化的树突状细胞、骨髓来源的抑制性细胞、调节性T细胞和中心记忆CD8T细胞等免疫细胞有关；⑤结果显示，4个关键的线粒体自噬基因ALDH5A1、FBXL4、MCL1和STOM通过破骨细胞分化和免疫机制在激素性股骨头坏死进展中发挥关键作用，均具有较好的疾病预测效果，可能作为激素性股骨头坏死诊断和治疗的生物标志物。
https://orcid.org/0009-0006-5748-6947(黄柯琪)；https://orcid.org/0000-0003-3860-1568(陈跃平)

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关键词: 激素性股骨头坏死, 线粒体自噬, 机器学习, 免疫细胞浸润, 关键标志物

Abstract: BACKGROUND: Mitochondrial autophagy is closely related to the occurrence and development of steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (SONFH), but specific biomarkers and regulatory mechanisms remain unclear.
OBJECTIVE: To identify the key biomarkers of mitochondrial autophagy in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head using machine learning algorithms and to conduct an immune infiltration analysis.
METHODS: The SONFH datasets GSE123568 and GSE74089 were downloaded from the GEO database, serving as the training and validation sets, respectively. Differentially expressed genes between SONFH and control groups were selected, and weighted gene co-expression network analysis was performed. Mitochondrial autophagy-related genes were obtained from MitoCarta3.0 and intersected with differentially expressed genes and module genes. Two machine learning algorithms were utilized to identify key genes of SONFH mitochondrial autophagy, and validated using an external validation set. CIBERSORT and immune infiltration analysis were employed to assess the proportion of immune cells, and ssGSEA was used to analyze the correlation between mitochondrial autophagy genes and immune cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Differential analysis identified a total of 1 163 differentially expressed genes, including 663 upregulated genes and 500 downregulated genes. Weighted gene co-expression network analysis identified 4 key modules, comprising 1 412 module genes. Intersection with mitochondrial autophagy genes yielded 39 intersecting genes as disease-related mitochondrial autophagy genes. Gene ontology enrichment analysis showed that the biological processes were mainly related to heme metabolism, mitochondrial transport, nucleotide bisphosphate metabolism and thioester metabolism, and the cellular components were mainly related to mitochondrial matrix, mitochondrial outer membrane, organelle outer membrane and mitochondrial inner membrane, and the molecular functions were mainly related to fatty acid ligase activity, iron-sulfur cluster binding, and cofactor A ligase activity. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes enrichment analysis mapped out a total of six pathways, which were mainly related to fatty acid degradation, mitochondrial autophagy, butyric acid metabolism, fatty acid biosynthesis and cofactor biosynthesis. Through LASSO regression and RFE-SVM algorithm analysis, four intersecting genes (ALDH5A1, FBXL4, MCL1, and STOM) were identified. The receiver operating characteristic curves of the four core genes and the diagnostic column chart validation set were all greater than 0.9. The occurrence and development of SONFH were related to immune cells such as dendritic cells, bone marrow-derived suppressor cells, regulatory T cells, and central memory CD8 T cells. To conclude, the four key mitochondrial autophagy genes ALDH5A1, FBXL4, MCL1, and STOM play a crucial role in the progression of SONFH through osteoclast differentiation and immune mechanisms. Additionally, all four genes have good disease prediction efficacy and can serve as biomarkers for the diagnosis and treatment of SONFH.

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Key words: steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, mitophagy, machine learning algorithms, immune cell infiltration, key marker

中图分类号:

黄柯琪, 陈跃平, 陈尚桐, 李加根. 机器学习识别激素性股骨头坏死中线粒体自噬诊断标志物及免疫浸润分析[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(11): 2402-2410.

Huang Keqi, Chen Yueping, Chen Shangtong, Li Jiagen. Machine learning identification of mitochondrial autophagy diagnostic biomarkers and immune infiltration analysis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(11): 2402-2410.

图/表（结果） 8

2.1 激素性股骨头坏死差异基因使用“limma”包分析激素性股骨头坏死组和对照组的RNA-seq数据，设计校正后P < 0.05和|log2FC|使用> 0.58，总共筛选出1 163个差异基因，其中有663个上调基因和500个下调基因(图1A)。然后用火山图和热图可视化，火山图中显示上调的基因标注为橙点，下调的基因标注为蓝点。将排行前20个和后20个差异基因通过热图展示(图1B)。
2.2 WGCNA结果 WGCNA是发现基因与临床表型的好方法，通过结合差异表达基因挖掘出与临床疾病表型相关的关键基因。GSE123568没有异常值，数据集中未删除任何样本，对本数据集中位绝对偏差的前75%基因进行了WGCNA筛选，当软阈值功率=12时，评估参数R2大于0.5，构建了β=12软阈值能力的无标度网络(图2A)，并根据表达谱将基因分类为不同的模块。通过平均链接聚类(图2B)，模块的颜色越深，提示该模块相关性越强。在分析了正相关系数后选择了相关系数最强的模块，结果显示black模块(r=±0.52，P=6×10-4)、blue模块(r=±0.67，P=3×10-6)、brown模块(r=±0.67，P=4×10-6)和slmon模块(r=±0.7，P=4×10-7)的基因具有显著意义，其余无显著的模块(图2C)。最后，分别提取了上述4个模块中的基因，包括black模块43个基因、blue模块837个基因、brown模块335个基因和slmon模块中的197个基因，这1 412个基因被认为是与临床表型相关的关键基因。
2.3 整理激素性股骨头坏死的线粒体相关基因及GO、KEGG功能分析从“MitoCarta 3.0”数据库中收集和整理线粒体相关基因，共有1 136个基因，使用1 163个差异基因、WGCNA相关模块的1 412个基因和线粒体相关1 136个基因取交集得到激素性股骨头坏死线粒体相关基因，一共得到39个线粒体相关激素性股骨头坏死基因(图1C)。进行GO和KEGG功能富集分析(图3)，GO富集分析结果显示，生物过程主要涉及血红素代谢过程、线粒体运输、核苷酸双磷酸的代谢过程和硫酯代谢过程，细胞组分主要涉及线粒体基质、线粒体外膜、细胞器外膜和线粒体内膜，分子功能主要涉及脂肪酸连接酶活性、铁-硫簇结合和辅酶A连接酶活性，将每项功能的前5项分析结果可视化；KEGG富集分析结果显示共映射出6条通路，主要涉及脂肪酸降解、线粒体自噬、丁酸代谢、脂肪酸生物合成和辅因子生物合成。
2.4 两种机器学习筛选诊断标志物利用R软件的“random Forest”包对39个差异基因进行随机森林算法，并绘制分组误差图和基因重要性图谱，共筛出16个基因，以重要性分数0.5为基准共筛出9个特征基因(图4A，B)。利用LASSO模型进行内部验证，共获得5个特征基因(图4C)。将2种机器学习的结果取交集得到4个诊断标志物(图4D)，分别是ALDH5A1、FBL4、MCL1和STOM。
2.5 风险模型构建与验证将上述结果中的4个线粒体基因纳入风险研究，并基于二分类逻辑回归分析，构建列线图模型，以计算总评分来分析激素性股骨头坏死患者的风险概率(图5)。结果显示，线粒体4个基因的受试者工作特征曲线结果显示曲

线下面积值均> 0.9(图6)，说明线粒体4个基因对激素性股骨头坏死具有良好的诊断价值。列线图的受试者工作特征曲线结果显示曲线下面积为0.98，说明列线图模型对股骨头坏死患者风险因素的评估具有较好的预测能力(图6A)。
2.6 免疫浸润分析通过CIBERSORT反卷积算法以P < 0.05样本进行筛选。热图左侧10个样本(GSM3507251-GSM3507260)为对照组，右侧30个样本(GSM3507261-GSM3507290)为激素性股骨头坏死组，免疫细胞比例箱图中展示了22种免疫细胞的浸润比例(图7)。创建了一个热图来描述免疫细胞之间的差异相关模式(图8A)，红色越深代表二者正相关性越高，蓝色越深代表二者负相关性越高，高正相关性的组合有活化的CD8T细胞与效应记忆CD8T细胞、骨髓来源的抑制性细胞与中心记忆CD4T细胞，其中发现活化的树突状细胞与T滤泡辅助细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、浆细胞样树突状细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞均具有高正相关性。负相关性较高的组合自然杀伤细胞与未成熟树突状细胞、2型T辅助细胞与巨噬细胞，其中发现活化的CD4T细胞与多种免疫细胞均呈高负相关，包括活化的树突状细胞、骨髓来源的抑制性细胞、调节性T细胞和中心记忆CD8T细胞等免疫细胞。
免疫浸润热图结果显示，激素性股骨头坏死样本的免疫浸润丰度远高于对照组，其中包括中心记忆CD4T细胞、活化的CD4T细胞、骨髓来源的抑制性细胞和T滤泡辅助细胞等多数免疫浸润细胞(图8B)。免疫差异细胞箱向图结果显示，免疫细胞表达在激素性股骨头坏死和对照组有显著差异，中心记忆CD4T细胞、效应记忆CD8T细胞、骨髓来源的抑制性细胞和记忆B细胞在激素性股骨头坏死组中的表达显著高于对照组。在诊断标志物与免疫细胞相关性热图中，MCL1与骨髓来源的抑制性细胞、中性粒细胞、效应记忆CD8T细胞、T滤泡辅助细胞和活化的树突状细胞呈正相关，而ALDH5A1、FBXL4和STOM与上述免疫细胞呈负相关(图8C，D)。

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引言

激素性股骨头坏死是临床上常见的一种非创伤性股骨头坏死类型，是由长期或大剂量应用糖皮质激素导致的股骨头缺血性坏死疾病，发病率逐年上升[1]。既往研究表明，长期接受糖皮质激素治疗的患者中有9%-40%会发生骨坏死，使用糖皮质激素导致的股骨头坏死概率与糖皮质激素使用剂量呈正相关[2-3]，其中30%-50%的患者发生骨折与使用糖皮质激素相关，另有5%-40%的患者发生了骨坏死。KURODA等[4]认为长期或过量使用激素类药物诱发的血脂异常是激素性股骨头坏死发病的病因之一；HOUDEK等[5]发现骨髓间充质干细胞脂向分化加强和骨向分化减弱是使用激素类药物后股骨头塌陷的原因之一；此外同样有研究表明，激素性股骨头坏死的病因与骨形成减少、骨吸收增强、骨组织细胞凋亡和氧化应激学说相关，但是关于激素性股骨头坏死的发病机制学术界仍未得到共识[6-7]。目前对激素性股骨头坏死患者而言，随着股骨头进行性的破坏与塌陷加重，若不能及早进行有效干预，后期则需行全髋关节置换手术[8]。因此，需要进一步明确激素性股骨头坏死的病因，寻找预后关键因素及治疗靶点。
线粒体是细胞内主要的能量供应中心，能够通过氧化磷酸化合成细胞氧气消耗驱动的ATP[9]。线粒体自噬介导的线粒体消除在炎症、代谢转化和细胞重编程等过程中起重要作用。受损的线粒体不仅丧失产生ATP和其他生物合成产物的能力，而且还释放出更高水平的活性氧，如不及时清除会在细胞中积累导致细胞死亡[10]。线粒体自噬通过去除功能失调或过多的线粒体来维持线粒体处于最佳状态。线粒体的稳态是通过去除和生物生产的平衡来维持的，而这种平衡可能会被不受控制的线粒体自噬所破坏[11]，不受控制的线粒体状态会导致骨、神经系统、心血管、肝、肾和骨骼肌等疾病[12]。
有研究表明，糖皮质激素能够促进机体广泛回收受损的细胞器，从而引起细胞死亡或细胞凋亡[13]；动物细胞体外实验与体内实验结果均表明，长时间使用激素会引起线粒体功能障碍、小胶质细胞氧化应激和焦亡[14-15]。因此，糖皮质激素有可能是通过诱导线粒体功能障碍进而影响骨组织细胞的凋亡与自噬，推动股骨头坏死的发展。基于上述关联，进一步研究线粒体自噬在激素性股骨头坏死中的作用将提高对激素性股骨头坏死发病机制的认识。
此次研究的主要目的是通过生物信息学分析与机器学习识别潜在的线粒体相关标志物，基于诊断标志物预测激素性股骨头坏死的发生风险，同时探讨线粒体自噬在激素性股骨头坏死中的作用机制和免疫浸润情况，旨在实现早期干预，延缓或阻断疾病的进展，以避免进一步恶化和可能导致残疾的后期阶段，为激素性股骨头坏死预防和治疗提供新思路和靶点。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1 资料和方法 Data and methods
1.1 设计 WGCNA分析、多种机器学习、诊断列线图、免疫浸润分析结合外部基因集验证。
1.2 时间及地点实验于2023年11月至2024年3月在广西中医药大学完成。
1.3 资料从GEO公共数据库(https://www.ncbinlm.nih.gov/geo/)筛选股骨头坏死相关微阵列数据集。搜索关键字“osteonecrosis of the femoral head”，搜索方法如下：“osteonecrosis of the femoral head”[MeSH 术语]，过滤掉非人相关基因芯片，最后得到GSE123568和GSE74089基因数据集，测序平台分别为：GPL15207(Affymetrix Human Gene Expression Array)；GPL13497(Agilent-026652 Whole Human Genome Microarray 4x44K v2)。训练集GSE123568数据集包括30例激素性股骨头坏死样本和10例对照样本的外周血清样本。验证集GSE74089数据集包括4例股骨头坏死样本和4例对照样本。
1.4 方法
1.4.1 激素性股骨头坏死差异分析 GSE123568和GSE74089基因数据集使用R软件整理相关矩阵数据，使用R软件(版本：4.2)中“limma”包对表达矩阵进行去重复、分位数归一化和标准化处理，再利用高级的t检验分析并根据假设检验对P值进行校正，筛选出logFC的绝对值> 0.58且校正后P < 0.05的基因作为差异基因。使用ggplot2绘制差异基因的火山图和差异热图。
1.4.2 加权基因共表达网络分析使用R软件对GSE123568全部基因表达矩阵进行加权基因共表达网络分析(Weighted correlation network analysis，WGCNA)，WGCNA是用来描述不同样品之间基因关联模式的系统生物学方法，可以用来鉴定高度协同变化的基因集，并根据基因集的内连性和基因集与表型之间的关联鉴定候补生物标记基因或治疗靶点。该分析方法旨在寻找协同表达的基因模块，并探索基因网络与关注的表型之间的关系以及网络中的核心基因。对标准化处理过后的基因表达矩阵使用R语言中“WGCNA”包和“limma”包分别进行删除离群样本，样本聚类构建拓扑重叠矩阵和无尺度网络，动态模块分析及合并，找出临床信息相关性最强的基因模块，整理模块中的基因为下一步筛选核心基因做准备。
1.4.3 筛选激素性股骨头坏死线粒体自噬基因及GO、KEGG功能分析从“MitoCarta3.0”数据库(https://www.broadinstitute.org/)中收集和整理线粒体自噬基因[16]。使用差异表达基因、WGCNA相关模块基因和线粒体自噬基因取交集得到激素性股骨头坏死线粒体自噬基因，将交集基因通过在线网站jvenn(https://jvenn.toulouse.inrae.fr/app/index.html)使用venn可视化[17]。然后整理相关基因，使用R包“clusterProfiler”进行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)功能富集分析，将相关富集分析结果可视化。
1.4.4 两种机器学习筛选诊断标志物采用随机森林(random forest algorithm，RF)与最小绝对收缩和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator，LASSO)2种机器学习算法来预测特征生物标志物。随机森林是一种多功能的机器学习方法，基于多个决策树的构建筛选特征基因，可用于分类和回归任务。LASSO主要用于回归分析，用于变量选择和降维，以提高产生统计模型预测的准确性和可解释性。运用R语言“glmnet、e1071、kernlab和caret”包对股骨头坏死线粒体相关基因进行LASSO回归分析及随机森林分析，使用网页工具将LASSO回归分析及随机森林分析结果进行交集，得到激素性股骨头坏死线粒体自噬基因。
1.4.5 风险模型预测使用R软件(包括“dplyr”和“survival”)来读取和处理数据，使用“rms”包来建立逻辑回归模型。逻辑回归是一种用于二分类问题的监督学习模型，可以用于预测患有或不患有激素性股骨头坏死的风险。根据核心基因的表达水平计算出逻辑回归模型的系数，这些系数表示每个变量对风险的影响。使用“rms”包中的nomogram函数来绘制Nomogram 图，Nomogram图可视化模型的预测结果，提供预测患病风险的直观方式。
1.4.6 外部基因集受试者工作特征曲线验证诊断模型与核心线粒体自噬基因使用GSE74089外部验证集，采用受试者工作特征曲线对诊断标志物和诊断模型进行验证。使用“pROC”R包绘制受试者工作特征曲线，曲线下面积可以代表诊断测试的内在有效性，这是一个介于0.5-1之间敏感性和特异性的指标。曲线下面积越接近1，诊断效能越好。
1.4.7 CIBERSORT和免疫浸润分析通过R包使用CIBERSORT来估计基因表达数据中不同免疫细胞类型在样本中的相对比例。在MsigDB 数据库中输入“IMMUNITY”关键词，搜索相应gmt文件。接着通过“GSVA”R包对转化后的表达矩阵进行单样本基因集富集分析(single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA)评分，ssGSEA是一种免疫浸润分析的工具，其中共包含29项免疫评分，从而可估算每个样本的免疫浸润程度，通过“pheatmap”软件包绘制热点图。随后采用ssGSEA算法来全面评估研究中包含的每个样本的免疫学特征和每个免疫细胞的相对浸润丰度，探究不同免疫细胞之间的相关性，计算不同免疫细胞间的Pearson相关系数，用星号数量来表示系数的大小。通过R语言中的“corrplo”软件包对免疫细胞之间和免疫功能之间的相关性进行相关性分析，并绘制热图。采用“psych”R 语言软件包对ssGSEA和线粒体基因表达矩阵的2个结果文件进行分析，并构建相关性热图。
1.5 主要观察指标 ①线粒体凋亡基因的差异分析；②机器学习模型的构建与选择；③列线图模型的构建与验证；④免疫浸润结果。

讨论

激素性股骨头坏死是一种长期不合理服用糖皮质激素导致的具有高致残率的慢性疾病，以股骨头骨组织缺血、坏死和塌陷为特征[18-19]。激素性股骨头坏死可导致患者发生缓慢进展性髋关节功能受损，临床可出现持续性髋关节疼痛、僵硬和功能障碍等症状，在无医疗干预的情况下多数可导致残疾[20]。随着糖皮质激素在风湿免疫性疾病治疗中的广泛应用，因激素性股骨头坏死导致残疾的患者在临床上越来越多[21]，因此疾病早期的预防和治疗对于预防后期致残至关重要，构建激素性股骨头坏死的预测模型和研究其发病机制具有重要临床价值。
线粒体是细胞内主要的动力源，是产生ATP能量的重要场所，也是决定细胞走向和功能的信号活动的枢纽[22]。线粒体除了能产生ATP，同时还可参与调控细胞内各种信号的转导过程、维持Ca2+稳态、调控细胞凋亡以及产生活性氧等[23]。线粒体功能主要包括线粒体氧化应激、线粒体动力学、线粒体自噬，是维持细胞内稳态的重要内源性机制[24]，其中线粒体自噬是通过自噬介导的溶酶体降解特异性去除受损或不必要线粒体的过程，它是研究最充分的选择性自噬类型[25]。
线粒体自噬受损和受损线粒体的积累导致细胞和组织损伤并与多种病理有关，包括神经退行性疾病、肌病、代谢紊乱、炎症、自身免疫性疾病和癌症，线粒体功能异常对激素性股骨头坏死的发生发展有着重要影响[26]，但是具体的作用方式尚不清楚。此次研究在GEO数据库中检索得到激素性股骨头坏死表达基因，线粒体自噬基因数据从MitoCarta 3.0数据库得到，经过生物信息学分析后，两者取交集得到激素性股骨头坏死与对照组的差异基因，通过机器学习识别4个潜在的线粒体诊断标志物，标志物可能与激素性股骨头坏死的发病机制密切相关，通过诊断标志物建立风险模型列线图预测疾病发生的风险，然后进行免疫浸润分析，对线粒体在激素性股骨头坏死的作用机制进行初步探讨。
激素性股骨头坏死中线粒体相关基因的GO和KEGG富集分析显示，主要涉及氧化应激反应、线粒体自噬、线粒体基质、线粒体外膜、细胞器外膜和线粒体内膜。其中氧化应激反应会引起关节结构生物分子损伤，同时作为细胞内信号传导组分可产生各种炎症反应，影响股骨头坏死的发展[27]。在氧化应激反应环境下，线粒体功能受损并在细胞内蓄积，释放出过量的活性氧和凋亡诱导因子，不仅氧化损伤DNA、蛋白质、脂质等生物大分子，还激活c-JunN末端激酶、P38丝裂原活化蛋白激酶、DNA损伤应答和P53通路，最终导致细胞应激凋亡和衰老，加剧股骨头坏死的进展[28-30]。磷酸酶和张力蛋白同源物的有效抑制剂能够通过抑制线粒体凋亡途径和激活NF-E2相关因子2信号传导，来逆转甲泼尼龙通过诱导细胞凋亡、破坏正常线粒体结构和破坏线粒体功能带来的负面影响。
目前针对激素性股骨头坏死研究多种多样，包括铁死亡、自噬等热点研究[31-32]，然而尚缺乏针对激素性股骨头坏死与线粒体之间的特征基因研究。此次研究运用WGCNA分析及多种机器学习方法(随机森林和LASSO 回归)识别激素性股骨头坏死中的线粒体相关基因，最终获得特征基因ALDH5A1、FBXL4、MCL1和STOM，使用风险模型列线图和外部数据集受试者工作特征验证分析，认为上述4个基因作为预测激素性股骨头坏死准确性较高，进而为从线粒体角度研究激素性股骨头坏死提供新思路。
ALDH5A1在肿瘤中多有研究，在胶质母细胞瘤细胞系中，ALDH5A1敲低可抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡并降低细胞迁移潜力[33]。有一项甲状腺状癌研究发现，ALDH5A1水平与肿瘤分期、转移、淋巴结分期呈正相关，ALDH5A1表达的降低可能通过抑制细胞增殖、迁移和侵袭以及逆转上皮-间充质转化来抑制甲状腺状癌的进展[34]。在其他罕见病中亦可见其身影，ALDH5A1基因中的致病变异导致琥珀酸半醛脱氢酶功能障碍，导致潜在毒性代谢物的积累，进一步导致一种名为琥珀酸半醛脱氢酶缺乏症的单基因疾病[35]。但目前尚未看到ALDH5A1在激素性股骨头坏死中的研究，此次研究的发现可为激素性股骨头坏死研究多提供一条方向。
MCL1是一种多样化的细胞调节蛋白，最显著的是其在Bcl-2家族中的抗凋亡作用，MCL1与细胞自噬标志物结合并增强功能失调线粒体的消除，起到对抗细胞凋亡的作用[36]。MCL1具有许多改变细胞命运的功能，既可以作为抗凋亡Bcl-2家族蛋白，也可以通过调节细胞分化、细胞周期调节、双链DNA断裂修复、线粒体动力学和生物能量代谢来发挥作用[37]。在线粒体自噬方面，MCL1可调节线粒体自噬，MCL1通过抑制泛素蛋白连接酶易位到去极化线粒体来抑制线粒体自噬[38]。有研究发现，在人体免疫方面，MCL1的过表达会加剧过敏性气道炎症并抵抗嗜酸性粒细胞凋亡[39]。有研究发现，DNA损伤会导致MCL1表达上调，从而结合并促进检查点激酶1的磷酸化和激活，检查点激酶1是一种蛋白激酶，有停止细胞周期以进行DNA修复的功能[40]。MCL1可能是通过调节线粒体相关功能促进股骨头坏死的发展。经过PubMed检索发现，STOM、FBXL4基因多数跟癌症相关，在股骨头坏死中的作用目前没有相关研究报道。因此，上述基因是否为激素性股骨头坏死的诊断标志物，有待进一步实验研究证明。
通过免疫浸润分析发现，激素性股骨头坏死与巨噬细胞、活化树突状细胞密切相关，巨噬细胞已被证明在骨生物学中发挥着多种作用，也是一种高度可塑的细胞类型[41]。在骨愈合过程中，巨噬细胞可引起肉芽组织的血管化纤维结缔组织取代损伤诱导的血肿[42]，在该肉芽组织中启动合成代谢机制并逐步形成有结构的骨膜骨痂或骨内骨桥，这种临时骨骼结构被缓慢重塑，以恢复正常的骨骼结构和强度特性[43]。树突状细胞是最有效的抗原呈递细胞，在存在核因子κB配体受体激活剂和巨噬细胞集落刺激因子的情况下也可以转分化为活性破骨细胞，导致骨破坏和骨吸收[44]。上述结果表明，激素性股骨头坏死免疫浸润可能涉及到免疫细胞周期变化、炎症递质释放、激活破骨细胞等方面导致疾病进展。
综上所述，该研究结合生物信息学和机器学习探究线粒体基因在激素性股骨头坏死中的作用机制，发现线粒体可能通过影响免疫应答、炎症反应和激活破骨细胞等过程作用于股骨头坏死，并与骨质降解、血管破坏等紧密相关，这可以为开展后续研究提供更好的思路，而ALDH5A1、FBXL4、MCL1和STOM这4个基因有望成为预测疾病发生和治疗的关键点。总之，通过线粒体自噬相关的诊断标志物可以更好地预测激素性股骨头坏死的发生风险，从而可提前采取措施来延缓或阻断疾病的进展。这一方法有望提高治疗效果，减少患者痛苦，为激素性股骨头坏死患者带来更好的生活质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

机器学习识别激素性股骨头坏死中线粒体自噬诊断标志物及免疫浸润分析

Machine learning identification of mitochondrial autophagy diagnostic biomarkers and immune infiltration analysis in steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

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