1.1 设计 纳米颗粒制备与表征实验，体外细胞实验，组间比较进行双因素方差分析(Two-Way ANOVA)、Dunnett’ Multiple comparisons test检验。
1.2 时间及地点 实验于2023-01-01/12-31在四川省双流区成都前沿医学中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄雄性SD大鼠4只，体质量(100±10) g，购自成都达硕实验动物公司，许可证号：SCXK(川)2020-0030。实验方案获得四川大学华西口腔医院医学伦理委员会批准(WCHSIRB-D-2023-669)。
1.3.2 原料、试剂与仪器 二甲基咪唑、无水乙醇、10%氯化十六烷基吡啶(阿拉丁，中国)；六水合硝酸锌(百灵威，中国)；α-MEM培养基、胎牛血清、胰酶、PBS(pH=7.2)缓冲液和青霉素/链霉素购于Gibco试剂公司(美国)；50 nm Fe3O4超顺磁性氧化铁纳米颗粒溶液(瑞禧生物，中国)；手持数字高斯计(天恒TD8620，中国)；各种型号圆形磁铁片(12 mm×3 mm、15 mm×3 mm、18 mm×3 mm，斐帝星，中国)；CCK-8试剂盒(APE×BIO，中国)；β-甘油磷酸钠(索莱宝，中国)；抗坏血酸、地塞米松、0.2%茜素红染液(pH=4.2)(西格玛奥德里奇，美国)；活死细胞染色试剂盒、碱性磷酸酶显色试剂盒、碱性磷酸酶检测试剂盒、BCA试剂盒(碧云天，中国)；X射线衍射仪(日本岛津6100)；纳米粒径分析仪(美国布鲁克海文)；振动样品磁强计(美国Lakeshore7404)；扫描电子显微镜(中国凯奇)。
1.4 方法
1.4.1 Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒的合成
ZIF-8纳米颗粒的合成：采用水热法合成ZIF-8纳米颗粒。称量384 mg二甲基咪唑、38.4 mg六水合硝酸锌，分别溶于1.2，1 mL纯水中，得到均质透明溶液。取150 μL二甲基咪唑溶液逐滴缓慢加入125 μL六水合硝酸锌溶液中，37 ℃超声水浴下混合30 min，用无水乙醇充分洗涤并重复3次，10 000 r/min离心2 min，弃上清后收集沉淀，真空干燥得到ZIF-8白色粉末。
Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒的合成：采用一锅法合成Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒。称量384 mg二甲基咪唑、38.4 mg六水合硝酸锌，分别溶于1.2，1 mL纯水中，得到均质透明溶液。取不同体积(10，20，40，80 μL)的2.5 mg/mL Fe3O4溶液与二甲基咪唑溶液(140，130，110，70 μL)混合得到150 μL总溶液，逐滴缓慢加入125 μL六水合硝酸锌溶液中，37 ℃超声水浴下混合30 min，用无水乙醇充分洗涤并重复3次，10 000 r/min离心2 min，弃上清后收集沉淀，真空干燥得到Fe3O4@ZIF-8棕色强磁性粉末，分别记为Fe3O4@ZIF-8(10)、Fe3O4@ZIF-8(20)、Fe3O4@ZIF-8(40)、Fe3O4@ZIF-8(80)。
1.4.2 Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒的表征 将ZIF-8粉末和Fe3O4@ZIF-8粉末分散在无水乙醇溶液中超声振荡2 min，干燥固定，使用扫描电子显微镜观察表面的晶体形貌。使用X射线衍射仪进行X射线衍射检测，表征ZIF-8和Fe3O4@ZIF-8粉末的晶格、结晶取向及结晶度，初步证明材料的成功合成，相关参数(2θ范围：5°-80°；扫描模式：连续)。在26.85 ℃、1 989.4-2 387.3 A/m快扫条件下，使用振动样品磁强计检测Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒的磁特性。将粉末样品分散在纯水溶液中进行超声振荡，使用纳米粒径分析仪评估ZIF-8和Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒的粒径分布范围和稳定性。通过材料表征实验结果，筛选出合适的Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒用于后续实验。
1.4.3 骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 取4周龄SD大鼠4只，乙醚吸入性麻醉后颈椎脱位处死，无菌条件下取股骨、胫骨，剔除附着于骨上的其他组织，在含1%双抗(青霉素/链霉素)的PBS中冲洗3遍，剪开骨骺端露出骨髓腔，用5 mL注射器吸取含体积分数为10%胎牛血清和1%双抗的α-MEM(完全培养基)冲出骨髓腔中的骨髓，接种到T25培养瓶中，期间每2 d换1次液，直至细胞融合80%-90%时开始传代[10]。
将骨髓间充质干细胞传至第三四代，用流式缓冲液洗涤3次，按照流式抗体说明书的标准步骤处理细胞并转移至专用流式管中，采用流式细胞仪分析细胞表面抗原CD45、CD11b、CD29、CD90的表达。
1.4.4 磁场设置 将若干块圆形钕铁硼磁铁片(12 mm×3 mm、15 mm×3 mm、18 mm×3 mm)分别固定在12，24，48孔板中，置于培养细胞孔板下，于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中建立静磁场。利用高斯计测量出50，100，150 MT磁场强度大小，以确保细胞培养层面都受到相同的静磁场刺激，筛选出最佳磁场强度进行后续体外实验。另外，采用数字化3D打印技术制作磁铁嵌入式的树脂壳，解决不同磁场强度间圆形磁铁片高度不一出现相吸相斥的问题。在筛选出准确数值后，后续实验装置在孔板内进行即可。
1.4.5 Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒对骨髓间充质干细胞活性的影响
CCK-8法检测细胞增殖：称取10 mg ZIF-8粉末、10 mg Fe3O4@ZIF-8粉末，分别溶于1 mL完全培养基中，超声振荡后得到10 mg/mL的材料原液，此时每1 μL材料原液可得10 μg粉末，按照浓度梯度25，50，75，100，125 μg/mL配置成终体积1 mL的完全培养基。将生长状况良好的骨髓间充质干细胞接种于48孔板中，细胞密度1×104/孔，分组培养：ZIF-8组加入含不同质量浓度(25，50，75，100，125 μg/mL)ZIF-8的完全培养基1 mL，Fe3O4@ZIF-8组加入含不同质量浓度(25，50，75，100，125 μg/mL)Fe3O4@ZIF-8的完全培养基1 mL，以空白对照组(加入单纯的完全培养基1 mL)为参照。每组4个复孔。培养1，3，5 d后，每孔加入200 µL含10%CCK-8的培养基，置于培养箱中孵育2 h，使用酶标仪在450 nm光波下测定吸光度值，筛选出最佳的材料溶液质量浓度。
筛选出材料溶液质量浓度后，将生长状况良好的骨髓间充质干细胞接种于48孔板中，细胞密度1×104/孔，分组培养：ZIF-8组加入含50 μg/mL ZIF-8的完全培养基1 mL并暴露在静磁场下(磁场强度分别为0，50，100，150 MT)，Fe3O4@ZIF-8组加入含50 μg/mL Fe3O4@ZIF-8的完全培养基1 mL并暴露在静磁场下(磁场强度分别为0，50，100，150 MT)，以空白对照组(加入单纯的完全培养基1 mL)为参照。每组4个复孔。培养1，3，5 d后，弃去上清液，每孔加入200 µL含10%CCK-8的培养基，置于培养箱中孵育2 h，使用酶标仪在450 nm光波下测定吸光度值。筛选出最佳的Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒与磁场强度，进行骨髓间充质干细胞活死细胞染色与诱导分化实验。
活死细胞染色：将生长状况良好的骨髓间充质干细胞接种于48孔板中，细胞密度1×104/孔，分组培养：ZIF-8组加入含50 μg/mL ZIF-8的完全培养基1 mL，Fe3O4@ZIF-8组加入含50 μg/mL Fe3O4@ZIF-8的完全培养基1 mL，Fe3O4@ZIF-8+磁场组加入含50 μg/mL Fe3O4@ZIF-8的完全培养基1 mL并暴露在100 MT静磁场下，以空白对照组(加入单纯的完全培养基1 mL)为参照。每组4个复孔。培养1，3，5 d后，将5 μL钙黄绿素(Calcein-AM)和15 μL 碘化丙锭(PI)加入5 mL PBS中充分混合，取200 μL混合溶液加入孔板内，置于培育箱中避光孵育20 min，使用490 nm激发波长来观察活细胞荧光，542 nm激发波长观察死细胞荧光。
1.4.6 Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒对骨髓间充干细胞分化的影响
(1)成骨诱导分化：将第3代骨髓间充质干细胞接种于6孔板内，细胞密度5×104/孔，待细胞融合至70%时分组培养：空白对照组更换为成骨诱导培养基(α-MEM培养基中加入10 mmol/L的β-甘油磷酸钠、0.25 mmol/L的抗坏血酸和10 nmol/L地塞米松)，ZIF-8组更换为含50 μg/mL ZIF-8的成骨诱导培养基，Fe3O4@ZIF-8组更换为含50 μg/mL Fe3O4@ZIF-8(40)的成骨诱导培养基，Fe3O4@ZIF-8+磁场组更换为含50 μg/mL Fe3O4@ZIF-8(40)的成骨诱导培养基并暴露在100 MT静磁场下。每2 d更新1次成骨诱导分化培养基(含材料)。培养7 d后进行碱性磷酸酶染色、Runx2蛋白质量浓度检测，培养14 d后进行茜素红染色。
碱性磷酸酶染色：将细胞在40 g/L多聚甲醛中固定15 min，用PBS清洗，按照碱性磷酸酶显色试剂盒内BCIP/NBT工作液进行染色，30 min后体式显微镜下观察结果。然后根据碱性磷酸酶检测试剂盒说明书的标准步骤对样本进行处理，使用酶标仪测定波长为405 nm时的吸光度值，随后结合BCA试剂盒测得的总蛋白量，计算出各组的碱性磷酸酶活性。
Runx2蛋白质量浓度检测：1 000 r/min离心5 min，收集上清，采用Elisa试剂盒检测Runx2蛋白质量浓度。步骤按照试剂盒说明书操作。
茜素红染色：将细胞固定在40 g/L多聚甲醛中30 min，用0.2%茜素红溶液染色5 min，用PBS彻底清洗染色样品以去除多余的染料，在体视显微镜下检查底物，将10%氯化十六烷基吡啶添加到每孔中以溶解染料，摇床缓慢振荡30 min，使用酶标仪测量542 nm处的吸光度值。
(2)成脂诱导分化：将第3代骨髓间充质干细胞接种于6孔板内，细胞密度5×104/孔，待细胞融合至70%-80%时分组培养：空白对照组更换为成脂诱导培养基(α-MEM培养基中加入200 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、10 μg/mL 胰岛素和1 μmol/L地塞米松)，ZIF-8组更换为含50 μg/mL ZIF-8的成脂诱导培养基，Fe3O4@ZIF-8组更换为含50 μg/mL Fe3O4@ZIF-8(40)的成脂诱导培养基，Fe3O4@ZIF-8+磁场组更换为含50 μg/mL Fe3O4@ZIF-8(40)的成脂诱导培养基并暴露在 100 MT静磁场下。每2 d更新1次成脂诱导分化培养基(含材料)。培养7 d后进行油红O染色。
油红O染色：将细胞在40 g/L多聚甲醛中固定15 min，用PBS清洗，按照油红O染色试剂盒说明书的标准步骤进行处理，比色定量结果用60%异丙醇处理染色样品30 min，使用酶标仪测量510 nm处的吸光度值。
1.5 主要观察指标 磁刺激下Fe3O4@ZIF-8纳米颗粒对骨髓间充质干细胞增殖与成脂、成骨分化的影响。
1.6 统计学分析 所有实验数据至少进行了3个独立实验(n≥3)。数据采用Origin pro 2022软件进行双因素方差分析(Two-Way ANOVA)与Dunnett’ Multiple comparisons test检验，以x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经四川大学华西公共卫生学院生物统计学专家审核。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
