2型糖尿病对各年龄段全身骨密度影响的两样本孟德尔随机化分析

doi:10.12307/2024.575

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (35): 5662-5668.doi: 10.12307/2024.575

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2型糖尿病对各年龄段全身骨密度影响的两样本孟德尔随机化分析

黄文茁1，向海珠1，马玮玮1，黄新1，付红军2，熊勇1

1湖北中医药大学，湖北省武汉市 430061；2襄阳市中医医院，湖北省襄阳市 441001

收稿日期:2023-10-28 接受日期:2023-12-02 出版日期:2024-12-18 发布日期:2024-03-15
通讯作者: 付红军，硕士，副主任医师，襄阳市中医医院，湖北省襄阳市 441001 熊勇，博士，副教授，副主任医师，硕士生导师，湖北中医药大学，湖北省武汉市 430061
作者简介:黄文茁，男，1997年生，湖北省襄阳市人，汉族，湖北中医药大学中医骨伤科学在读硕士，主要从事中医药预防骨质疏松症的研究。向海珠，女，1997年生，湖北省宜昌市人，汉族，湖北中医药大学中西医结合在读硕士，主要从事中西医结合心血管方向的研究。

Effect of type 2 diabetes mellitus on bone mineral density in different age groups: a two-sample Mendelian randomization study

Huang Wenzhuo1, Xiang Haizhu1, Ma Weiwei1, Huang Xin1, Fu Hongjun2, Xiong Yong1

1Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China; 2Xiangyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Xiangyang 441001, Hubei Province, China

Received:2023-10-28 Accepted:2023-12-02 Online:2024-12-18 Published:2024-03-15
Contact: Fu Hongjun, Master, Associate chief physician, Xiangyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Xiangyang 441001, Hubei Province, China Xiong Yong, MD, Associate professor, Associate chief physician, Master’s supervisor, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China
About author:Huang Wenzhuo, Master candidate, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China Xiang Haizhu, Master candidate, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430061, Hubei Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨密度：是骨骼强度的一个重要指标，以g/cm3表示，也是目前骨质疏松症临床评估的黄金标准之一。
孟德尔随机化：是一种基于遗传变异的因果推断方法，其基本原理是利用自然界中随机分配的基因型对表型的影响来推断生物学因素对疾病的影响。

背景：流行病学研究显示2型糖尿病与骨密度存在相关性，但两者间的因果关联以及是否与年龄有关仍是未知。

目的：基于孟德尔随机化技术研究2型糖尿病与不分年龄段及各年龄段全身骨密度的相关性。
方法：从布里斯托尔大学的IEU GWAS 数据库中选择2型糖尿病与各年龄段骨密度的GWAS数据，其中暴露数据集中获取与2型糖尿病具有显著相关性的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)作为工具变量，将各年龄段骨密度选定为结局变量，采用逆方差加权法、加权中位数法以及MR-Egger 回归进行2型糖尿病与骨密度的两样本孟德尔随机化分析，以β值来评价2型糖尿病与各年龄段骨密度之间的因果关系。

结果与结论：①从GWAS汇总数据共提取118个SNP作为工具变量，MR-Egger回归结果显示不存在水平多效性，但存在异质性，因此研究以逆方差加权法结果为准。②逆方差加权法结果显示，2型糖尿病可能是骨密度的潜在保护性因素，且与年龄存在相关性 [未指定年龄骨密度(β=0.038，95%CI：1.01-1.07，P=0.002)，> 60岁骨密度(β=0.052，95%CI：1.01-1.09，P=0.027)，> 45-60岁骨密度(β=0.049，95%CI：1.01-1.09，P=0.009)，> 30-45岁骨密度(β=0.033，95%CI：0.99-1.07，P=0.127)，> 15-30岁骨密度(β=0.025，95%CI：0.95-1.10，P=0.506)，0-15岁骨密度(β=0.006，95%CI：0.96-1.04，P=0.716)]。MR-Egger回归及加权中位数也有类似结果。③结果表明2型糖尿病可能是骨密度的保护性因素之一，且与年龄存在相关性。

https://orcid.org/0000-0002-1379-4378(黄文茁)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 孟德尔随机化, 2型糖尿病, 骨密度, 因果推断, 单核苷酸多态性

Abstract: BACKGROUND: Epidemiologic studies have shown a correlation between type 2 diabetes mellitus and bone mineral density, but the causal association between the two and whether it is age-related remains unknown.
OBJECTIVE: To study the correlation between type 2 diabetes mellitus and whole body bone mineral density at unspecified age and at all ages based on the Mendelian randomization technique.
METHODS: The genome-wide association study (GWAS) data of type 2 diabetes mellitus and bone mineral density at all ages were selected from the IEU GWAS database of the University of Bristol. The exposure data were single nucleotide polymorphisms with significant correlation with type 2 diabetes mellitus as instrumental variables, and bone mineral density at all ages was selected as the outcome variable. Two-sample Mendelian randomization analysis of type 2 diabetes mellitus and bone mineral density was performed using inverse variance weighted method, weighted median estimator, and MR-Egger regression. The βvalue was used to evaluate the causal relationship between type 2 diabetes mellitus and bone mineral density at all ages.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 118 single nucleotide polymorphisms were extracted from the GWAS summary data as instrumental variables. The MR-Egger regression results showed that there was no horizontal pleiotropy, but there was heterogeneity. Therefore, this study was based on the inverse variance weighted results. Inverse variance weighted results showed that type 2 diabetes mellitus may be a potential protective factor for bone mineral density and is associated with age: age-unspecified bone mineral density [β=0.038, 95% confidence interval (CI): 1.01-1.07, P=0.002], bone mineral density over 60 years old (β=0.052, 95% CI: 1.01-1.09, P=0.027), bone mineral density between 45-60 years old (β=0.049, 95% CI: 1.01-1.09, P=0.009 ), bone mineral density between 30-45 years old (β=0.033, 95% CI: 0.99-1.07, P=0.127). bone mineral density of 15-30 years old (β=0.025, 95% CI: 0.95-1.10, P=0.506), bone mineral density of 0-15 years old (β=0.006, 95% CI: 0.96-1.04, P=0.716 ). Similar results were obtained from the MR-Egger regression and weighted median estimator analyses. These findings indicate that type 2 diabetes mellitus may be one of the protective factors of bone mineral density, and there is a correlation with age.

Key words: Mendelian randomization, type 2 diabetes mellitus, bone mineral density, causal inference, single nucleotide polymorphism

中图分类号:

黄文茁, 向海珠, 马玮玮, 黄新, 付红军, 熊勇. 2型糖尿病对各年龄段全身骨密度影响的两样本孟德尔随机化分析[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5662-5668.

Huang Wenzhuo, Xiang Haizhu, Ma Weiwei, Huang Xin, Fu Hongjun, Xiong Yong. Effect of type 2 diabetes mellitus on bone mineral density in different age groups: a two-sample Mendelian randomization study[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(35): 5662-5668.

图/表（结果） 5

2.1 工具变量筛选结果经过数次筛选，共筛选出118个SNP。所纳入SNP 基本信息，见表2。

2.2 孟德尔随机化分析估算结果逆方差加权法结果显示2型糖尿病可能是未指定年龄段骨密度的保护性因素之一(未指定年龄骨密度：β=0.038，95%CI：1.01-1.07，P=0.002)；通过对2型糖尿病与各年龄段的骨密度数据进行分析发现，2型糖尿病可能在> 45岁骨密度的人群中，其保护因素更加具有统计学意义。MR-Egger回归、加权中位数及逆方差加权法3种分析结果见表3；2型糖尿病与不分年龄段骨密度以及各年龄段分析结果散点图见图2。

2.3 敏感度分析结果留一分析显示2型糖尿病与骨密度之间的联系不是单一SNPs所主导的，敏感性分析结果显示在逐一排除法中未发现对因果关联估计值影响较大的 SNPs。2型糖尿病与未指定年龄段及各年龄段骨密度留一图见图3。其中2型糖尿病与未指定年龄段骨密度的Cochran’s Q检验结果如下：逆方差加权法分析(Q=251.057 3，P=2.589 068×10-12)；MR-Egger分析(Q=250.434 7，P=2.051 155×10-12)，2型糖尿病与各年龄段骨密度的Q检验结果及多效性检验结果见表4。结果表明，2型糖尿病与未指定年龄段骨密度以及45岁以上年龄段骨密度的SNP间存在异质性，2型糖尿病与未指定年龄段骨密度以及各年龄段骨密度的SNP间均不存在水平多效性，因此关注随机效应逆方差加权法模型。漏斗图结果显示当某一SNP作为工具变量时，其表示因果关联效应的点对称分布，结果表明因果联系受到潜在偏倚影响较小，详见图4。基于以上分析，MR-Egger回归结果不具有水平多效性，提示逆方差加权法分析的结果可作为因果关系的主要标准，因此可以得出2型糖尿病可能是骨密度的保护性因素之一，其相关性可能与年龄相关。

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引言

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨小梁缓慢流失和骨密度降低为特征的全身性代谢骨疾病[1]。据流行病学调查显示，目前全球有超过2亿人受到骨质疏松症的困扰，随着全球人口老龄化的加重，预计这一数字将继续上升[2-3]。双能X射线骨密度仪测量所得的骨密度值是国际学术界公认的诊断骨质疏松症的金标准之一，目前临床普遍通过评估患者的骨密度来协助诊断骨质疏松症[4]。2型糖尿病作为威胁全球老年患者的重大疾病[5]，是目前临床骨折风险评估工具(fracture risk assessment tool，FRAX)的重要指标之一[6]，其所致代谢紊乱被认为是老年患者骨质疏松发生乃至骨折发生率增高的重要原因[7]，但随着研究的深入，这一观点开始受到研究人员的质疑。在第4次全美健康及营养调查中，研究者发现2型糖尿病患者的骨密度普遍较高，且没有人种和性别的区别[8]，该研究结果显示2型糖尿病对骨骼具有一定的保护作用。然而，目前关于2型糖尿病与骨密度之间关系的研究主要是基于观察性研究，可能存在各种偏倚、混杂因素与反向因果的影响，并受到因果时序性的限制，这都影响了研究结果的准确性。因此，为了更全面地了解2型糖尿病与骨密度之间的关系，需要采用更为精确的研究设计和方法探究二者的确切影响。
孟德尔随机化分析是一种广泛应用于临床流行病学研究的方法，其原理是利用基因遗传变异作为工具变量来分析暴露因素与结局事件之间的因果联系[9]。由于遗传变异在受孕时就已确定，一般不易受其他因素或混杂影响，同时孟德尔随机化分析研究满足因果时序性，而在因果推断中时序性是构成因果关系的依据[10-12]。因此，此次研究以全基因组关联研究的公共数据作为基础对不同年龄段的双样本进行孟德尔随机化分析，探索2型糖尿病和骨密度之间的关联关系。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计两样本孟德尔随机化分析，进行Q检验及多效性检验。
1.2 时间及地点实验于2023年2-9月在湖北中医药大学完成。

1.3 资料从英国布里斯托尔大学的IEU GWAS数据库(https://gwas.mrcieu.ac.uk/terms/)获取2型糖尿病和骨密度的全基因组关联研究数据(Genome-Wide Association Studies，GWAS)用于研究。暴露变量是2型糖尿病，结局变量是为骨密度(0-15岁、> 15-30岁、> 30-45岁、> 45-60岁及> 60岁人群的骨密度)，相关信息参见表1。

1.4 实验方法

1.4.1 研究设计思路研究将2型糖尿病作为暴露因素，并从暴露数据集中筛选与其显著相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNP)作为工具变量(instrumental variables，IVs)参与分析。结局变量包括不同年龄段(0-15岁、> 15-30岁、> 30-45岁、> 45-60岁及> 60岁)的骨密度。采用双样本孟德尔随机化分析的方法来探究2型糖尿病与各年龄段骨密度之间的因果关联，利用Cochran’s Q检验和MR Egger法对异质性和水平多效性进行评估，以确保分析结果的稳健性[13]。最后，进行敏感度分析来验证研究结果的可靠性。孟德尔随机化分析需要满足3个条件假设[14]：①工具变量和暴露因素之间具有很强相关性；②工具变量在暴露和结果的关联性上不存在混合因素，即不存在遗传多态性；③工具变量对结果没有直接影响，只能通过暴露因素影响结果，见图1。

1.4.2 数据整理首先，根据千人全基因组欧洲人群的参考，选择与2型糖尿病具有显著意义的SNP(选择标准：P < 5.0×10-8)，将连锁不平衡参数(r2)设置为0.001，并将遗传距离设为10 000 kb，以确保工具变量之间的独立性，排除连锁不平衡的干扰[14]。然后，对于结局中缺失的SNPs，使用与其具有较强连锁不平衡(r2 > 0.8)的SNPs进行填补缺失。最后，整理和合并从2型糖尿病和各年龄段骨密度数据集中提取的暴露和结局数据，确保暴露和结局的对应值与相同的效应等位基因相对应[15]。
1.4.3 孟德尔随机化分析采用3种孟德尔随机化分析方法对研究数据进行了深入分析，包括逆方差加权法(inverse variance weighted，IVW)、MR-Egger回归和加权中位数法(weighted median estimator，WME)。逆方差加权法方法通过确保工具变量不受水平多效性影响，利用每个工具变量方差的倒数作为权重进行加权计算，并忽略截距项，从而获得所有工具变量效应值的加权平均，从而推断暴露因素与结局变量之间的因果关系[16]。与逆方差加权法方法相比，MR-Egger回归最大的区别在于引入了截距项，同时也使用结局方差的倒数作为权重来进行拟合[17]。加权中位数法是一种有效的分析方法，其定义为比率估计值的加权经验密度函数的中位数。在分析中，若超过一半的数据为有效工具，则可以一致性地估计因果关系[18]。当所有纳入的SNP均符合有效工具变量的标准时，逆方差加权法方法提供了准确的估计[19-20]。因此，在此研究中，如果没有弱的工具变量存在，将以逆方差加权法方法作为主要结果。然而，若分析中少于50%的权重由有效工具变量所占，加权中位数法也能够提供一个合理的因果关系估计[20]。通过综合运用这3种不同的孟德尔随机化分析方法，能够全面评估2型糖尿病与不同年龄段骨密度之间的因果关联，确保研究结果的可靠性。
1.4.4 敏感度分析在孟德尔随机化分析研究中，敏感性分析用于评估单个SNP对因果关联的可能性，通过逐个剔除工具变量来检验其对孟德尔随机化分析结果的影响，以揭示可能存在的干扰因素[16]。MR-Egger截距则用于评估工具变量与其他潜在混杂因素之间的多效性关系，以确保所选择的工具变量不会通过除暴露因素以外的途径影响结局变量，从而保障孟德尔随机化分析的准确性。同时，Cochran’s Q统计量用于检验研究结果的一致性，发现不同研究间可能存在的差异。这些方法在孟德尔随机化分析研究中起到了检验工具变量有效性、混杂因素影响和研究结果一致性的重要作用，有效提升了孟德尔随机化分析的可信度和解释力。
1.5 主要观察指标 ①工具变量筛选的结果；②孟德尔随机化分析估算结果；③敏感度分析。
1.6 统计学分析结果P值< 0.05被认为具有统计学意义。所有研究过程使用R Studio(版本4.1.0)软件进行分析，并使用Twosample MR包进行处理，结果进行Q检验及多效性检验。文章的统计学方法已经湖北中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

此次研究旨在探究2型糖尿病与骨密度之间的关系，以及2型糖尿病患者在各年龄骨密度的相互影响，以便指导临床医师针对2型糖尿病患者用药，并对2型糖尿病患者群体内心的恐惧及焦虑具有积极影响。研究使用了公开的数据进行孟德尔随机化分析，结果显示2型糖尿病患者拥有更高的骨密度。鉴于2型糖尿病患者年龄分布较广，作者对不同年龄段2型糖尿病患者与骨密度进行了分析，结果表明，2型糖尿病与各年龄段及不分年龄段骨密度呈正相关，且随着年龄的增高，2型糖尿病与骨密度的因果关联逐渐显著。具体而言，在45岁以下人群的分析结果显示，2型糖尿病与骨密度之间各项分析P值结果均> 0.05，因果关系并不显著，但β值均> 0、OR值> 1，暗示可能存在正相关。然而，在> 45-60岁及> 60岁以上的人群中，逆方差加权法结果显示P值均< 0.05，具有统计学意义，且β值均> 0、OR值> 1，说明2型糖尿病可能是骨密度的保护因素之一，且随着年龄的增加，2型糖尿病对骨密度的正向因果关系更加可靠。
近年来，2型糖尿病的发病出现年轻化的趋势，且发病率逐年上升，青年人群成了2型糖尿病患病率增速最快的群体[21]，有研究指出青年2型糖尿病患者发病时间较早，具有症状发生率低及血糖控制不佳的特点[22]，但对于青年2型糖尿病组患者并发症的各项研究中并未有2型糖尿病与骨质疏松症相关性的报道。这些研究认为，0-45岁年龄段青壮年时期2型糖尿病患者骨骼生长处于平衡状态，故2型糖尿病与骨密度的关系并不具有密切相关性，这些研究结果与此次研究结果相同，在< 45岁的2型糖尿病患者中各项分析结果P值结果均> 0.05，因果关系并不显著。在成年后，伴随着年龄的增加，2型糖尿病与骨质疏松症之间似乎变得有因果关系，值得注意的是，大量研究显示衰老会导致骨形成受损和骨量减少[23]，并且多项研究也表明衰老引起的内分泌老化及DNA损伤都会导致骨质流失[24]。提及衰老，端粒是细胞有丝分裂的“生物钟”，是国内外公认的细胞衰老标志。随着年龄的增加，端粒长度不断缩短，2型糖尿病患者氧化应激较未患病人群加剧，端粒长度的损害更容易导致2型糖尿病的并发症及合并症的发生。在2项两样本孟德尔随机化研究中分别表明2型糖尿病于骨密度与端粒长度均不具有关联性[25-26]，但在此次的孟德尔随机化的分析中，2型糖尿病患者人群在0-45岁年龄段与> 60岁年龄段中体现出了差异，这可能与2型糖尿病患者产生的叠加效应影响了正常的骨转换率有关。
既往有研究结果表明，空腹胰岛素及胰岛素抵抗水平的增加与骨密度的升高相关[27]。证据表明，线粒体自噬在调节胰岛素抵抗和代谢稳态中起着关键作用[28]，线粒体自噬与年龄密切相关，当机体衰老后，其自噬调节能力也随之下降，随着年龄及2型糖尿病病情的发展，2型糖尿病患者产生的叠加效应更加明显，胰岛素抵抗患者大多处于肥胖状态[29]，而肥胖与高骨密度息息相关。2型糖尿病患者的骨密度可能涉及肥胖、胰岛素、雌激素和瘦素等机械负荷和荷尔蒙因素[30-33]。有研究表明年龄不同，雌激素对骨密度所起的作用也不同[34]，肥胖在影响雌激素水平的同时，也对骨密度起到调节作用。相关研究还讨论了空腹血糖和糖化血红蛋白与骨密度的关系，结果显示随着空腹血糖和糖化血红蛋白水平的升高，骨质疏松症的患病率显著降低，这与多项观察性研究结果相一致[34-38]。此外，一些学者进行了关于血糖水平与骨细胞分化的动物实验研究，发现健康组和2型糖尿病组的破骨细胞活力在相同的葡萄糖水平下没有显著差异，但随着葡萄糖浓度的增加，2型糖尿病组的破骨细胞活力逐渐降低，并且高血糖水平同时抑制了骨基质的吸收[39]，从而导致骨密度增加。另外，胰岛素水平和肥胖程度在糖尿病引起骨质疏松症的病理生理过程中也发挥一定作用。研究者发现脂肪细胞数量和脂肪堆积可以促进瘦素的分泌，适度肥胖可以促进瘦素的分泌并加速间充质干细胞向成骨细胞的分化，从而显著提高骨量[40]。
同时，一些常用于治疗2型糖尿病的药物，如二甲双胍和胰高血糖素样肽1受体激动剂(GLP-1RAs)，在相关研究中显示对骨密度产生影响。有研究表明，二甲双胍治疗通过AMPK途径正向调节线粒体自噬和炎性小体活化，并通过促进焦亡来消除“慢性活化”巨噬细胞减少慢性炎症和高血糖恶化，对糖尿病骨质疏松症起正向调节作用[41]。另外，根据Meta研究，胰高血糖素样肽1受体激动剂可以通过降低骨代谢指标CTX水平来促进骨形成[42]，其作用机制可能与TLR4 /
MyD88 通路有关，在改善糖尿病骨质疏松症的同时，还能改善血清炎性水平[43]。近年来，由于肠-骨-脑轴的确定，肠促胰素这类较新的降糖药物对骨代谢的作用也成为了内分泌代谢疾病领域的科研热门话题，肠促胰素能够通过直接或间接的作用促进成骨细胞增殖，并且能够使成骨细胞的活性得到增强，进而对骨质形成起到促进的作用[42]。
相关研究表明糖尿病对骨骼微结构产生密切影响，涉及多种因素改变骨骼特性，包括骨动态、骨质及微结构等骨骼特征的变化[23]。即使在骨密度正常的情况下，糖尿病患者的骨骼特性异常也会增加骨折的风险，可能与2型糖尿病并发症(如视力和平衡功能障碍等)有关，这些并发症会导致跌倒风险增加，进而导致骨折风险升高[27]。一项对照试验的结果显示，Dickkopf相关蛋白的积聚可能与骨强度减弱有关，这些蛋白质在细胞信号传导和发育过程中扮演重要角色，尤其在骨骼发育、细胞增殖和分化等方面发挥重要功能，同时这种蛋白的积聚可能抑制成骨细胞的形成，导致骨强度减弱[44]。
综上所述，此次研究中的孟德尔随机化分析发现2型糖尿病与未指定年龄段骨密度以及各年龄段骨密度的关系存在因果关联。但在临床研究中，2型糖尿病与骨密度之间的关系存在多种混杂因素，例如合成代谢激素水平降低、炎症等，而正向关联的机制尚未达成共识。此次研究采用两样本孟德尔随机化分析方法，不易受其他因素或混杂影响，单纯地分析2型糖尿病与不分年龄段及各年龄段的相关性，对指导临床用药及缓解2型糖尿病患者群体内心的恐惧及焦虑具有积极影响。需要指出的是，研究使用了GWAS汇总数据库，缺乏个体级别的数据，因此难以进行性别、病程、治疗和疾病分型的亚组分析，也无法比较不同亚组间的因果关系差异。因此，在未来的研究中，需要更多的临床数据支持和验证。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

2型糖尿病对各年龄段全身骨密度影响的两样本孟德尔随机化分析

Effect of type 2 diabetes mellitus on bone mineral density in different age groups: a two-sample Mendelian randomization study

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