2.1   牙髓干细胞的体外培养与鉴定结果   应用组织块法进行牙髓干细胞的体外培养，24-48 h组织块贴壁后加高浓度血清培养液，培养约7 d时观察到有贴壁梭形细胞爬出。免疫荧光染色检测显示CD90、CD146呈阳性表达，CD34呈阴性表达，见图1，符合牙髓干细胞特性，上述细胞传代培养，第3-6代细胞用于后续实验。



2.2   云南白药及iRoot BP Plus浸提液对细胞增殖的影响   应用MTT法检测云南白药及iRoot BP Plus浸提液对细胞增殖的影响，见图2，3。







随着时间的增加，不同质量浓度云南白药组的牙髓干细胞相对数量均增加。第1天，当云南白药质量浓度≤75 μg/mL时，随着云南白药质量浓度的升高细胞数量无明显变化，当云南白药质量浓度为100 μg/mL时，细胞数量有所升高；第3天，当云南白药质量浓度≤75 μg/mL时，随着云南白药质量浓度的升高细胞数量无明显变化，当云南白药质量浓度为100 μg/mL时，细胞数量出现下降；第5天，当云南白药质量浓度≤50 μg/mL时，细胞数量略有降低，而云南白药质量浓度为50-75 μg/mL时，细胞数量随着云南白药质量浓度的增加而升高，而在云南白药质量浓度为100 μg/mL时，细胞数量出现明显下降，即当云南白药浸提液质量浓度为75 μg/mL时，药物对牙髓干细胞增殖的影响最小，细胞毒性小，因而在后续实验中，云南白药浸提液选用75 μg/mL质量浓度。
随着时间增加，不同质量浓度iRoot BP Plus浸提液组细胞数量同样整体呈增加趋势。第1天和第3天，当iRoot BP Plus浸提液质量浓度≤100 μg/mL时，细胞数量随iRoot BP Plus质量浓度升高而增加，当iRoot BP Plus质量浓度≥100 μg/mL时，细胞数量无明显变化；在第5天，在质量浓度≤100 μg/mL时细胞数量随着iRoot BP Plus质量浓度升高而增加，当质量浓度为150 μg/mL时，细胞数量未见继续增加，且当质量浓度升至200 μg/mL时，细胞数量反而较之前下降，通过上述实验结果，选择质量浓度为100 μg/mL的iRoot BP Plus浸提液应用于后续实验。
2.3   云南白药及iRoot BP Plus浸提液对脂多糖诱导下牙髓干细胞炎症的影响    炎症对照组肿瘤坏死因子α mRNA相对表达量均高于正常对照组(P < 0.001)，表明经脂多糖处理后细胞进入炎症状态，细胞炎症模型建立成功。经云南白药、iRoot BP Plus及其联合应用处理1，3 d后，肿瘤坏死因子α mRNA相对表达量均低于炎症对照组(P < 0.001)，表明上述2种药物对炎症相关因子肿瘤坏死因子α mRNA均具有抑制作用，在上述2个时间点云南白药组对肿瘤坏死因子α mRNA相对表达量的抑制作用明显强于iRoot BP Plus组，云南白药+iRoot BP Plus组对肿瘤坏死因子α mRNA相对表达量的抑制作用强于2个单独处理组。初步认定云南白药对牙髓干细胞炎症状态的抑制作用较iRoot BP Plus具有明显优势，且2种药物具有协同作用，见图4。




2.4   云南白药及iRoot BP Plus浸提液对脂多糖诱导下牙髓干细胞矿化结节生成的影响   与正常对照组相比，炎症对照组矿化结节的相对数量较低，说明炎症状态对牙髓干细胞的成骨分化能力有一定的抑制作用。与炎症对照组相比，经云南白药、iRoot BP Plus及其联合应用处理后矿化结节数量显著增加，其中2种药物联合组矿化结节量高于单独用药组(P < 0.001)，见图5。结果表明云南白药和iRoot BP Plus均能促进牙髓干细胞产生矿化结节，且两者联合应用对矿化结节的产生具有正向叠加作用。



2.5   云南白药及iRoot BP Plus浸提液对脂多糖诱导下牙髓干细胞碱性磷酸酶活性的影响   炎症对照组碱性磷酸酶活性低于正常对照组，表明脂多糖刺激牙髓干细胞后碱性磷酸酶的表达降低(P < 0.05)。云南白药组、iRoot BP Plus组及iRoot BP Plus+云南白药组的碱性磷酸酶活性均高于炎症对照组(P < 0.001)。云南白药组与iRoot BP Plus组碱性磷酸酶活性比较无统计学意义，但2种药物联合应用组碱性磷酸酶活性高于药物单独刺激组(P < 0.001)，见图6。表明云南白药及iRoot BP Plus可提高牙髓干细胞的碱性磷酸酶活性，且两者联合应用对于碱性磷酸酶活性的促进具有正向作用。




2.6   云南白药及iRoot BP Plus浸提液对脂多糖诱导下牙髓干细胞矿化相关基因表达的影响   用实时荧光定量PCR法检测第1，3，7天时矿化相关基因的表达，见图7，使用2-ΔΔCT公式计算，通过观察统计结果得出，经药物刺激后，MEPE mRNA的表达量大幅度增加发生在第3天，刺激3 d后，正常对照组与炎症对照组相比无统计学意义(P > 0.05)，与炎症对照组相比，云南白药组、iRoot BP Plus组和云南白药+
iRoot BP Plus组MEPE mRNA表达均明显升高(P < 0.001)，且云南白药+iRoot BP Plus组明显高于云南白药组和iRoot BP Plus组(P < 0.001)；刺激7 d后，正常对照组MEPE mRNA表达高于炎症对照组(P < 0.001)，云南白药组、iRoot BP Plus组和云南白药+iRoot BP Plus组MEPE mRNA表达均高于炎症对照组(P < 0.001)，云南白药+iRoot BP Plus组MEPE mRNA表达高于云南白药组和iRoot BP Plus组(P < 0.001)。



IBSP mRNA的相对表达量在药物刺激7 d后出现明显差异，此时正常对照组低于炎症对照组(P < 0.01)，云南白药组和iRoot BP Plus组高于炎症对照组(P < 0.01)，云南白药+iRoot BP Plus组高于炎症对照组(P < 0.001)，云南白药+iRoot BP Plus组高于云南白药组和iRoot BP Plus组(P < 0.001)。
DSPP mRNA的相对表达量在药物刺激7 d后出现明显差异，正常对照组与炎症对照组相比无统计学意义(P > 0.05)，iRoot BP Plus组和云南白药+iRoot BP Plus组高于炎症对照组(P < 0.001)，云南白药组高于炎症对照组(P < 0.01)，云南白药+iRoot BP Plus组高于云南白药组和iRoot BP Plus组(P < 0.001)。
在刺激7 d后，云南白药组和云南白药+iRoot BP Plus组的BGLAP mRNA相对表达量高于炎症对照组(P < 0.001)，而iRoot BP Plus组与炎症对照组相比均无统计学差异(P > 0.05)。
2.7   云南白药及iRoot BP Plus浸提液与脂多糖诱导下牙髓干细胞Akt/mTOR通路的关系   Akt磷酸化水平在正常对照组、炎症对照组之间无显著差异(P > 0.05)；iRoot BP Plus组(P < 0.05)、云南白药组(P < 0.001)、iRoot BP Plus+云南白药组(P < 0.001)Akt磷酸化水平明显高于炎症对照组。mTOR磷酸化水平在炎症对照组与iRoot BP Plus组无明显差异，云南白药组及iRoot BP Plus+云南白药组与炎症对照组比较，磷酸化水平均明显增加(P < 0.001)，见图8。

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牙髓炎是口腔中最为多发和常见的疾病之一，由于牙髓及其周围组织的特殊性，牙髓炎常难以自愈，并且病变不断加重，从而出现牙齿疼痛、牙髓坏死、牙髓及根尖周组织感染，严重者可导致牙齿丧失。现阶段，牙髓炎尤其是不可复性牙髓炎的治疗方法以根管治疗为主。根管治疗术后成功率因各种原因极不稳定，从其失败原因不难看出，根管解剖形态复杂增加了失败风险。另外，像器械分离、根管侧穿、根尖分歧、根管遗漏等并发症也增加了根管治疗的失败率，且根管治疗后牙齿失去牙髓血运营养，组织变脆，根管壁变薄弱，抗力减小，同样减少了牙齿的使用寿命。
活髓切断术常用于年轻恒牙根尖未封闭的暂时性保髓治疗，以保留根尖部生活牙髓促进根尖硬组织的继续发育。近年来随着新材料的不断发展和临床应用，活髓切断术作为保髓治疗的新手段，越来越多的应用于临床，其临床应用提升了牙髓保存成功率[1-2]，但其炎症的控制及矿化屏障的形成极大影响了其成功率。ZANINI等[3]在 Meta 分析后认为，在临床治疗操作时牙髓的状态对于医师判断患牙是否适用活髓切断术进行治疗至关重要。有研究表明，感染因素及感染牙髓组织的去除对牙髓炎的保髓治疗具有重要作用[4]，即使很严重的牙髓炎，只要控制好上述两点也可得到治愈。但目前临床上尚没有可信赖的技术手段对牙髓的炎症程度和状态进行预判，也尚无研究证明感染牙髓是否具有恢复活力的能力。一些动物实验模型显示，初始炎症状态下，直接或间接盖髓后，第三期牙本质形成的相关反应更少，也就是说炎症因子的残留同样会影响断髓处牙本质桥的形成[5]。为使活髓切断术更好地应用于临床治疗，为更多患牙保存活髓提供可能，扩大其适应证，期望找到兼具抗炎和促进矿化的药物。
肿瘤坏死因子α是一种强促炎细胞因子，是炎症起始的重要标志，在免疫系统炎症、细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥重要作用[6-7]。1975年，Carwell等首次将其描述为一种细胞因子，在免疫系统刺激后表现出明显的细胞毒活性，从而导致肿瘤坏死。肿瘤坏死因子是一种多效性分子，可增加白细胞毒性，刺激急性期炎症蛋白，诱导炎症细胞因子的产生，对牙髓感染反应至关重要，会限制成牙本质细胞样细胞从干细胞或祖细胞群分化，因而文章着重探讨肿瘤坏死因子α的表达。
盖髓材料的选择在治疗中占据重要地位，iRoot BP Plus是临床上常用于牙体牙髓相关疾病的药物[8-11]，具有优良的理化性质，包括良好的生物相容性、放射线阻射性、释放离子促进矿化、物理性质稳定、不使牙体组织变色、硬固亲水性等，常被应用于根尖屏障、直接盖髓、根管侧穿、髓室底修补等。
云南白药作为中国云南省特色中药，根据文献[12]和美国食品药品监督管理局的资料，云南白药主要包括三七、雪莲、板蓝根、金鸡花、天竺葵、白姜、牛蒡等，它被证明可以调节免疫功能和抗炎[13]。现今云南白药已被中医广泛应用于外伤性损伤和外科手术出血、咯血、便血和溃疡(溃疡性结肠炎、消化性溃疡、口腔溃疡和皮肤溃疡)的止血[12-13]。云南白药可用于单药治疗，也可与其他止血药物或抗溃疡药物联合使用。目前云南白药常被研究应用于牙周黏膜相关疾病的治疗，如牙龈炎及牙周炎出血，有动物实验证实其对菌斑指数、附着丧失均有减轻作用，但目前尚未用于牙体牙髓疾病的治疗[14]。另有部分研究表明，云南白药具有促进细胞矿化的作用[15]。
从恒牙或乳牙中分离的牙髓干细胞具有高度克隆性、多分化和神经血管特性[16-17]。研究表明，牙髓干细胞的起源可能与神经嵴源性细胞有关，通过特定的表面标记物证明其位于神经血管束附近。牙髓干细胞对维护牙髓内环境稳定和促进牙髓损伤修复具有重要作用。
该研究旨在探讨云南白药、iRoot BP Plus 及其联合应用对脂多糖作用下牙髓干细胞矿化的影响，并初步分析其相应机制。研究云南白药、iRoot BP Plus及其联合应用在活髓切断术盖髓材料应用领域的潜在作用，为活髓切断术适应证的扩大及云南白药的作用机制提供新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   体外细胞实验，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年10月至2022年6月在潍坊医学院附属医院及潍坊医学院口腔医学院实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验细胞   取自就诊于潍坊医学院附属医院14-20岁刚拔下的正畸减数牙牙髓，用于原代人牙髓干细胞提取。纳入标准：完整拔除的无牙体牙周硬组织疾病、无系统疾病，患者及其家属知情同意，且通过潍坊医学院附属医院伦理委员会批准，批准号：wyfy-2022-ky-072。
1.3.2   实验试剂   DMEM培养液(索莱宝，中国)；胎牛血清(Hyclone，美国)；磷酸盐缓冲液(索莱宝，中国)；CD34、CD90、CD146抗体(Abcam，英国)；脂多糖(索莱宝，中国)；胰蛋白酶(索莱宝，中国)；0.1%TrionX-100(索莱宝，中国)；牛血清白蛋白(碧云天生物技术公司)；DAPI(Abcam，英国)；TriQuik Reagent(索莱宝，中国)；茜素红S染液(索莱宝，中国)；提取总 RNA 试剂盒(TaKaRa，日本)；cDNA 反转录试剂盒(TaKaRa，日本)；Real time PCR 试剂盒(TaKaRa，日本)；碱性磷酸酶检测试剂盒(碧云天，中国)；BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒(碧云天，中国)；SYBR Green(索莱宝，中国)；引物(金斯瑞生物科技，中国)；Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR抗体(Cell Signaling Technology，美国)；云南白药(云南白药公司，中国)；iRoot BP Plus(Bio Ceramic Technology，加拿大)。
1.3.3   实验仪器   二氧化碳细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific，美国)；-80 ℃冰箱(Haier，中国)；光学显微镜(Leica，德国)；高速低温离心机(Eppendorf，德国)；ABI 7500 Fast Real-Time PCR 仪(ABI，美国)；双垂直电泳槽(Bio-Rad，美国)；超微量紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国)；水平摇床(北京六一，中国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   人牙髓干细胞培养   采用组织块法培养人原代牙髓干细胞，用体积分数为75%乙醇对牙齿表面消毒后放入DMEM培养基中转移至超净台，在无菌条件下劈开，取出牙髓组织，去除根尖2 mm，使用含5%双抗的无菌PBS冲洗3-5次，将牙髓组织剪至1 mm3大小后置于培养皿中，加入少量含体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养液，以不使组织块飘起为宜，放入体积分数为5%CO2、100%湿度，37 ℃细胞培养箱内培养，24 h后组织块贴壁，加培养液继续培养，7-10 d观察到梭形细胞爬出，换液，待细胞长至60%-70%融合时传代，更换含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养液，后续实验使用3-6代细胞。 

1.4.2   细胞鉴定   取第3代人牙髓干细胞进行细胞爬片，用37 ℃ 40 g/L多聚甲醛室温固定20 min，PBS洗3次，滴加0.1%Triton X-100室温孵育5 min，滴加5%BSA室温封闭1 h，加入CD34、CD90、CD146一抗(1∶50) 4 ℃避光孵育16 h，PBS洗3次，加入二抗孵育1 h，DAPI工作液室温孵育4 min，PBS洗3次，封固，拍照。
1.4.3   药物准备   ①取iRoot BP Plus，37 ℃湿润条件下固化48 h，取出烘干称质量，将其加入DMEM培养液中，质量浓度为10 mg/mL，37 ℃孵箱内放置72 h，每24 h振荡5 min，1 000 r/min离心5 min，收集上清，0.22 μm滤菌器过滤，4 ℃保存备用。②称取云南白药10 mg，溶于10 mL DMEM完全培养液中，37 ℃孵箱内放置3 d，每24 h振荡5 min，1 000 r/min离心5 min，收集上清，经0.22 μm滤网过滤，储存于4 ℃冰箱。
1.4.4   iRoot BP Plus、云南白药的药物毒性测试   取上述药物原液，分别配置含25，50，75，100 μg/mL云南白药的DMEM培养液，以及含50，100，150，200 μg/mL iRoot BP Plus的DMEM培养液，4 ℃冰箱储存备用。
取生长状态良好的第3-6代牙髓干细胞，细胞计数重悬后接种于96孔板，1×104个/孔，培养24 h后，实验组加入含上述质量浓度的云南白药及iRoot BP Plus的DMEM培养液，每孔加液100 μL，每2 d换液1次，每组设置5个复孔，对照组为不含iRoot BP Plus及云南白药的DMEM培养液，分别在1，3，5 d时终止培养，弃去板内培养液，PBS漂洗细胞3次，关闭房间内及超净台内灯光，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，避光继续培养4 h，弃去培养液，注意勿动底部沉淀，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液溶解沉淀，待沉淀完全溶解，超微量紫外可见分光光度计波长设置为490 nm，测定吸光度值记录并分析。
1.4.5   细胞分组   ①正常对照组：含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养；②炎症对照组：1 μg/mL脂多糖诱导2 h+含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养；③云南白药组：1 μg/mL脂多糖诱导2 h+含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养+75 μg/mL云南白药；④iRoot BP Plus组：1 μg/mL脂多糖诱导2 h+含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养+100 μg/mL iRoot BP Plus；⑤云南白药+iRoot BP Plus组：1 μg/mL脂多糖诱导2 h+含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养+100 μg/mL iRoot BP Plus+75 μg/mL云南白药。
1.4.6   碱性磷酸酶染色及半定量分析   将第3-6人牙髓干细胞按1×105个/孔细胞密度接种于6孔板，培养过夜后，按上述细胞分组加药，含药培养液干预10 d后，PBS洗3次，每次5 min，40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗涤3-5次，每次3-5 min，加入BCIP/NBT染色工作液室温避光孵育30 min，去除染色工作液，用蒸馏水洗涤终止显色反应，拍照。
待测样品去除培养基，PBS洗3次，加适量Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)，冰上裂解，刮下细胞，转移至1.5 mL离心管，4 ℃，12 000 r/ min离心10 min，取上清(约30 μL)，使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔，借助摇床进行混匀，37 ℃孵育30 min后加入反应终止液终止反应，用超微量紫外可见分光光度计在405 nm波长处测定吸光度值。
1.4.7   Real time-PCR   将第3-6人牙髓干细胞按1×105个/孔细胞密度接种于6孔板，培养过夜后，按上述细胞分组加药，含药培养液干预1，3，7 d后终止培养，PBS洗2次，每孔加入1 mL TriQuik Reagent裂解液，置于室温下裂解5 min(或-80 ℃备用)，4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清液，每管加入氯仿200 μL，充分混匀后室温静置两三分钟，4 ℃、12 000×g离心10 min，取上层液体至新管中，注意不可取到中间白色部分；加入异丙醇混匀，静置10 min，4 ℃、12 000×g离心10 min，弃上清，体积分数为75%乙醇清洗RNA沉淀，4 ℃、1 2000×g离心2 min，弃液体，室温晾干；加入DEPC水，溶解RNA沉淀，测定RNA浓度，注意每次测定结束后擦净液体，记录浓度，-80 ℃冰箱储存备用。PrimeScript RT Master Mix kit试剂盒进行反转录，设置反应条件为：37 ℃ 15 min ，重复3个循环，85 ℃ 5 s，1个循环，最后4 ℃保持。引物序列见表1[36]。

1.4.8   茜素红S染色   将第3-6代人牙髓干细胞按2×104个/孔的细胞密度接种于6孔板，待细胞长至60%融合时，按上述细胞分组加药，每3 d换液1次，培养21 d，弃培养液，PBS 清洗细胞两三次，40 g/L多聚甲醛室温下固定30 min，双蒸水清洗细胞两三次，茜素红染色液(40 mmol/L，pH=4.2)室温下避光染色20 min，弃去染色液，拍照，用ImageJ图像分析软件分析染色阳性面积，用百分数表示。 
1.4.9   免疫印迹实验   将第3-6代人牙髓干细胞按1×105个/孔的细胞密度接种于6孔板，培养过夜后，按上述细胞分组加药，含药培养液干预7 d后，裂解细胞提取总蛋白，BCA法测定总蛋白含量。所有样品用5×缓冲液混合，在100 ℃的水中煮沸10 min，每道共装载24 µg蛋白；蛋白用10% SDS-PAGE分离1.5 h，并在150 mA下转移到0.2 µm聚偏二氟乙烯膜1 h，随后在室温下用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1 h，根据染色前标记蛋白的分子量切割膜，并在4 ℃下与以下一抗孵育过夜：Akt，p-Akt，mTOR，p-mTOR(1∶1 000，Cell Signaling Technology，Inc.，Danvers，MA，USA)和β-actin (1∶5 000，Proteintech Group，Inc.)，加入二抗(1∶600，抗兔免疫球蛋白G，抗小鼠免疫球蛋白G)孵育1 h，ECL显色液显色，用Alpha View软件对蛋白条带的灰度值进行数字化分析。
1.5   主要观察指标   ①原代人牙髓干细胞形态及鉴定结果；②云南白药及iRoot BP Plus浸提液对细胞增殖的影响；③云南白药及iRoot BP Plus浸提液对脂多糖诱导下牙髓干细胞中肿瘤坏死因子α mRNA表达的影响；④云南白药及iRoot BP Plus浸提液对脂多糖诱导下牙髓干细胞矿化结节生成的影响；⑤云南白药及iRoot BP Plus浸提液对脂多糖诱导下牙髓干细胞碱性磷酸酶活性的影响；⑥云南白药及iRoot BP Plus浸提液对脂多糖诱导下牙髓干细胞矿化相关基因表达的影响；⑦云南白药及iRoot BP Plus浸提液对脂多糖诱导下牙髓干细胞Akt/mTOR蛋白表达及其磷酸化的影响。
1.6   统计学分析   每组实验重复3次，实验数据结果用x±s表示，用SPSS 26.0进行统计学处理，单因素方差分析做组间均数比较，两两比较采用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过潍坊医学院统计学专家审核。

3.1   云南白药、iRoot BP Plus对牙髓干细胞增殖的影响   人牙髓干细胞使用不同质量浓度云南白药浸提液培养1，3，5 d后，MTT实验结果表明，在药物作用5 d时随药物质量浓度的改变细胞增殖变化明显，其中75 μg/mL组细胞量明显高于其他组，因而选择75 μg/mL云南白药浸提液进行后续实验。
iRoot BP Plus是近年来口腔科尤其是牙体牙髓疾病治疗中的常用药物，其主要成分包括硅酸钙、氧化锆、氧化钽、硫酸钙、过磷酸钙增稠剂和填料等，具有良好的生物相容性、物理性质稳定性，不变色，材料固化需要水的参与具有亲水性，且黏固性良好，能与牙体组织壁紧密贴合，使用时无需调配，操作方便。因其优良的理化性质，常被做为盖髓材料，是活髓切断术现常用的盖髓材料之一。该实验中，将iRoot BP Plus在合适的条件下固化后进行浸提液的制备，使用MTT法检测不同质量浓度iRoot BP Plus对牙髓干细胞增殖的影响，通过3个时间点的各组数据对比发现，在100 μg/mL时细胞增殖水平基本达到最高，后续随着iRoot BP Plus质量浓度的升高，细胞增殖无明显变化，选择质量浓度为100 μg/mL的iRoot BP Plus浸提液应用于后续实验。
3.2   云南白药、iRoot BP Plus抑制牙髓干细胞炎症状态   炎症属于先天免疫的主要机制[18]，是机体对感染、抗原作用或组织损伤的反应。肿瘤坏死因子α是一种强促炎细胞因子，是炎症起始的重要标志。该研究在脂多糖诱导牙髓干细胞形成炎症状态后，使用云南白药、iRoot BP Plus及联合应用进行诱导，得出云南白药及iRoot BP Plus均对肿瘤坏死因子α 
mRNA的表达具有下调作用，且云南白药的作用明显强于iRoot BP Plus，云南白药可弥补iRoot BP Plus盖髓材料在抗炎作用上的不足。
3.3   云南白药、iRoot BP Plus促进牙髓干细胞矿化   碱性磷酸酶是一种金属酶[19]，由多种同工酶组成，是钙化机制中最早起作用的基因之一[20]。碱性磷酸酶在矿化组织细胞中高度表达，在硬组织的形成中起关键作用。碱性磷酸酶的表达提高是矿化成骨的重要标志[21-22]。
该研究中正常对照组矿化结节的形成及碱性磷酸酶活性均明显大于炎症对照组。经云南白药、iRoot BP Plus、云南白药+iRoot BP Plus干预后，与炎症对照组相比，其矿化结节染色量及碱性磷酸酶活性明显上升，当云南白药和iRoot BP Plus联合应用时，其碱性磷酸酶活性和矿化结节染色量高于药物单独作用，说明云南白药、iRoot BP Plus 均对炎症状态下牙髓干细胞的成牙本质化/矿化具有促进作用，且两者联合应用对牙髓干细胞的成牙本质化/矿化的促进作用要强于药物单独作用。
3.4   云南白药、iRoot BP Plus及其联合应用对牙髓干细胞矿化作用机制的初步探索   矿化屏障的形成对于根尖闭合的恒牙可逆性牙髓炎的成功治疗至关重要。已知云南白药具有抑制炎症、促进修复相关细胞因子释放、促进细胞骨/牙源性分化的作用。研究表明，BGLAP、DSPP、IBSP和MEPE均为SIBLING家族成员，与矿化密切相关[23]。BGLAP是成熟阶段成骨的标志，是骨基质的重要组成部分，被认为是骨转化过程的特异性标志，参与骨矿化的调控，当BGLAP不活跃时，它直接影响骨的形成、吸收和矿化[24-25]。DSPP是一种牙本质特异性蛋白，其表达反映了人牙髓干细胞的成牙本质细胞分化程度[26-27]。IBSP是骨矿化和成骨细胞分化所必需的。研究发现Akt/mTOR通路参与细胞周期、代谢和血管生成[28-29]。mTOR及其上游激活剂Akt对细胞生长、增殖、分化和存活发挥关键作用[30-33]。此外，研究表明Akt/mTOR通路参与细胞骨/牙源性分化相关过程[34]。
该研究在药物干预3 d时就可以观察到MEPE mRNA的表达变化，要早于其他基因，且它在后续时间中持续表达，参与矿化过程，因而考虑MEPE mRNA可能是矿化过程的启动因子，与矿化密切相关；在药物干预7 d时，DSPP、IBSP mRNA表达量升高，其组间差异基本符合各组矿化结节产生情况，且IBSP mRNA表达量明显高于其他基因，由此得出DSPP、IBSP mRNA在矿化过程的后期开始表达发挥作用，其中IBSP mRNA在后期矿化过程中占据主导地位；而BGLAP mRNA在矿化过程中作用不明显。各组间综合对比发现，干预7 d时云南白药组和iRoot BP Plus+云南白药组的MEPE、DSPP、BGLAP、IBSP mRNA表达均都高于其他组
(P < 0.05)，且Akt和mTOR蛋白的磷酸化水平显著增加，提示云南白药对牙髓干细胞的促矿化作用可能与Akt/mTOR通路有关。
另外，药物刺激第3天时，除正常对照组外，其他4组DSPP、BGLAP和IBSP mRNA表达均下降，此时MEPE mRNA表达显著升高，推测上述基因表达量的下降与MEPE mRNA表达升高及炎症刺激的继发影响相关。
根据上述实验结果初步推测药物刺激牙髓干细胞后通过Akt/mTOR通路首先激活其下游基因MEPE，启动矿化过程，进而激活DSPP及IBSP，在IBSP的主导作用下细胞碱性磷酸酶表达增加，从而诱导矿化形成。
结合上述实验结果，云南白药兼具促进矿化及抗炎作用，在应用于盖髓材料的选择方面具有传统材料所欠缺的优势，其对于牙髓干细胞炎症状态的抑制作用要优于iRoot BP Plus，有研究表明，其抗菌作用主要是其应用后使周围组织液pH值改变从而抑制细菌活性[35]。虽然作为盖髓材料云南白药并不能取代iRoot BP Plus的封闭作用，但综合研究结果显示，两者联用在抗炎和促矿化作用上均优于单药物作用。
综上所述，iRoot BP Plus、云南白药联合应用对炎症状态下牙髓干细胞的抗炎和矿化均有促进作用，满足牙髓治疗时，对于有轻微炎症残留的牙髓断面牙齿盖髓材料及药物的选择，可为临床用药提供参考。近年来临床医师逐渐将活髓切断术应用于根尖已封闭的恒牙可复性牙髓炎甚至某些符合要求的不可复性牙髓炎的治疗，这对于保存活髓，继续为牙齿提供养料具有很大意义，此项技术的成功能在一定程度上显著延长牙齿的使用寿命，而由于技术及某些方面的制约，活髓切断术的应用适应证有限，牙髓暴露后，一般通过大体观察牙髓状态及其出血情况判断牙髓炎症状态，因而常面临2个问题：已切断的牙髓断面下有无炎症，或某些患牙根管口操作空间不足，器械无法切到理想位置致使炎症残留，该研究将云南白药、iRoot BP Plus联用旨在补充此方面的不足，在一定程度上扩大适应证，从而延长了牙齿的寿命，同时降低了个体的医疗费用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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文题释义：

牙髓干细胞：是从牙髓组织中分离出的一种成纤维状细胞，与骨髓间充质干细胞有着极其相似的免疫表型及形成矿化结节能力，其形态呈梭形，具有高度克隆性、多分化和神经血管特性，对维护牙髓内环境稳定和促进牙髓损伤修复具有重要作用。
iRoot BP Plus：是一种新开发的、方便的、即得即用的硅酸钙基生物活性陶瓷，因其优良的理化性质常用于口腔科临床治疗。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

牙髓干细胞的矿化在活髓切断术治疗牙髓炎中占据重要地位，盖髓材料的选择对其炎症的控制及矿化屏障的形成至关重要；iRoot BP Plus作为近些年临床上常用的盖髓材料在应用于活髓切断术时有所欠缺，而云南白药目前尚未应用于牙髓疾病的治疗，实验发现其兼具抗炎及促矿化作用，对于活髓切断术中盖髓材料的选择极具优势，而iRoot BP Plus、云南白药联用对炎症状态下牙髓干细胞的抗炎和矿化均有促进作用，可为临床用药提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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