2.1   实验动物数量分析   9只术后大鼠均存活，并进入结果分析。
2.2   各组MRI检查结果   空白组大鼠Co6/7椎间盘髓核呈高信号，纤维环、终板呈低信号，两者界限清晰；对照组大鼠Co6/7椎间盘髓核信号降低，可见约一半髓核高信号椎间盘；实验组大鼠Co6/7椎间盘髓核信号完全消失，见图4。各组大鼠椎间盘Thompson系统分级，见表1。







2.3   各组椎间盘形态观察结果    苏木精-伊红染色显示，空白组椎间盘髓核完整，可见大量脊索细胞，纤维环排列有序，与髓核分界清晰；对照组髓核完整，可见较多脊索细胞，部分纤维环破裂；实验组髓核破裂，可见稀少脊索细胞，纤维环出现明显分层裂隙，见图5。

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椎间盘是在椎体之间传递压缩负荷及提供灵活性的重要组织[1]。流行病学调查研究发现，椎间盘退变是引起腰椎间盘突出症等疾病的根本原因，且至少40%的腰痛与椎间盘退变密切相关[2]。因此，研究椎间盘退变的病因和发病机制需要建立合适的动物模型以开展相关实验。

近年来，国内外学者针对椎间盘退变模型的建立进行了多种尝试，如结构损伤模型、应力改变模型、基因敲除模型等，其中结构损伤模型最为常见[3]。在干预方式方面，细针穿刺法具有重复性高及诱导时间相对较短的优点，而无水乙醇注射法可以模拟疾病自然状态下的缺血和营养供应不足进展过程[4]，因此上述两种方法常常作为建立结构损伤模型的常用手段。与腰椎间盘相比，尾椎间盘更容易定位和操作，是替代具有侵入性和技术挑战性腹膜或背外侧入路建立大鼠腰椎间盘退变的极佳选择，近年来越来越多研究开展了大鼠尾椎间盘的研究，特别是在形态学、生物学和分子研究方面[5-7]，运用大鼠尾椎间盘建立椎间盘退变模型已逐渐成为众多学者研究腰痛及椎间盘退变模型的选择。QIAN等[8]在大鼠尾椎进行针刺用具的长度对比，结果显示细针穿刺法造模效果佳，且18号针是建立大鼠退行性椎间盘模型的最佳选择。此外，YUAN等[9]及GE等[10]研究分别在大鼠尾椎建立退变椎间盘模型，证明针穿刺刺入后旋转360°及注射无水乙醇的造模效果良好。既往研究在干预部位方面，椎间盘结构损伤模型制作过程中的最大难点是缺乏影像学引导，可能造成位置穿刺不准确，导致造模效果不佳甚至失败。因此，此次实验通过对比X射线引导下、非X射线引导下穿刺并注射无水乙醇以观察大鼠椎间盘退变模型的效果，以期为研究椎间盘退变模型提供参考依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验。
1.2   时间及地点   实验于2020年12月至2021年8月在广州中医药大学实验动物中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   健康雌性SD大鼠9只，6月龄，SPF级，体质量(300±20) g，由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证：SYXK[粤]2018-0001，实验动物生产许可证：SYXK[粤]2018-0034。此次实验在广州中医药大学实验动物伦理委员会的批准及监督下进行，动物伦理审批：20191109002。实验动物在广州中医药大学实验动物中心饲养，分笼喂养，每笼为同组三四只动物，自由摄食饮水，每日早晚喂食，隔日换水，每日明暗时间各为12 h，模拟白天和黑夜，室温控制在23-26 ℃，湿度50%左右。
1.3.2   实验器械   精细镊-直/尖部、精细镊-45°弯/尖部、手术刀柄、手术刀片、非吸收涤纶缝线(带针)、OLSEN-HEGAR 持针钳(剪)、HALSTED 止血钳、18 G针头，10 mL注射器，一次性实验手套，大鼠固定板，纱布，纱块。
1.3.3   实验试剂   戊巴比妥钠(上海国药集团化学试剂有限公司)；盐酸多西环素可溶性粉(安庆市桐矿动物药业有限公司)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)；苏木精-伊红染液套装(Biossci)。
1.3.4   实验仪器   数字化X射线诊断X射线机(型号：AMULETF，苏州富士胶片映像有限公司)；MAGNETOM Skyra 3.0T超导磁共振成像系统(型号：NanoZoomer S360，德国西门子公司)。
1.4   实验方法   
1.4.1   实验分组   将实验动物标号后，按照随机数字法分为实验组、对照组、空白组，每组3只，标准条件下适应性饲养1周。
1.4.2   实验造模   所有动物术前2 h禁食。腹腔注射1%戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉大鼠。实验组大鼠摆放至俯卧位，进行尾椎X射线检查，先在X射线辅助下借助注射针头定位Co6/7椎间盘，X射线正位参数为80 kV、120 ms，X射线侧位参数为100 kV、160 ms，在拟进针处进行表皮标记，最后在表皮标记处进行垂直穿刺，穿刺至4 mm后，将注射器针头水平旋转360°，留针30 s后均匀缓慢注入无水乙醇40 μL，出针，见图1，2；对照组大鼠手动定位Co6/7椎间盘，做好表皮处标记，固定大鼠尾巴，消毒，手术刀纵向切开尾部标记部位皮肤，用镊子、组织剪分离皮下结缔组织和肌肉组织，予止血钳固定，暴露术野；用注射器针头对Co6/7椎间盘进行垂直穿刺，穿刺至4 mm后，将注射器针头水平旋转360°，留针30 s后均匀缓慢注入无水乙醇40 μL，出针，见图3。操作完成后缝合伤口[10]。空白组大鼠不进行任何操作。

1.4.3   术后处理   造模后继续按照标准饲养条件下饲养，笼内自由活动，正常饮食，连续3 d伤口换药及涂抹多西环素5 g抗感染，密切观察伤口情况。
1.5   主要观察指标   
1.5.1   影像学检查   术后1周，麻醉下每组选取3只大鼠行MRI检查，在MRI T2图像上观察大鼠椎间盘退变情况，观察其信号强弱，以及纤维环与终板两者的界限。MAGNETOM Skyra 3.0T超导MRI成像系统的T2加权像参数参数设计，TR：3 500 ms，TE：107 ms，FOV：80 mm，Thickness：1.5 mm。根据改良的4级Thompson系统分级[11]：1级，正常；2级，信号轻度下降；3级，信号中度降低；4级，信号显著减少。级别越高退变越明显。
1.5.2   组织病理学检查   处死结束影像学检查后的大鼠，尽量完整截取其Co6/7椎间盘组织，用无菌生理盐水清洗表面血迹，然后放入固定液中固定24 h以上；将组织从固定液取出，在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，水洗20 min后，进行脱水透明浸蜡；将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋，将蜡块置于石蜡切片机以4 µm厚度进行切片，制成石蜡切片。选取以上石蜡切片进行脱蜡至水，再使用苏木精染色液(Harris)染色3-5 min，自来水洗一两分钟，之后入伊红染液(醇溶性)染一两秒，不需水洗，直接浸入体积分数95%乙醇，无水乙醇中脱水一两分钟，封固成片，置于光镜下观察椎间盘形态变化。
1.6   统计学描述   采用三线表的形式，统计各组大鼠干预后Thompson分级参数及具体构成比。
1.7   出版规范   该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

此次实验采用无水乙醇破坏终板微循环，并结合经典的纤维环穿刺法，综合MRI及椎间盘病理苏木精-伊红染色结果，发现穿刺造模方法处理后大鼠Co6/7椎间盘髓核信号均有不同程度的降低，X射线引导穿刺组更为明显。此外，X射线引导穿刺组的髓核、纤维环形状可见不同程度的破裂、结构紊乱，脊索细胞数量下降等改变。上述改变提示穿刺造模方法均能不同程度地诱导椎间盘退变，X射线引导穿刺组退变更为明显。

大鼠腰椎部分覆盖多层肌肉及椎间盘后方如棘突、椎弓根等骨性结构复杂，腰椎穿刺造模等干预方式易造成棘突、椎弓根损伤，且在腰椎造模是一个较大的侵入性手术，可操作性较低且大鼠术后预后较差[12]。大鼠尾椎椎间盘解剖结构仅有椎间盘、椎体和皮肤，造模时穿刺损伤可以实现单独破坏椎间盘和局部皮肤，并有研究表示尾椎间盘可被用来观察机械负荷引起的椎间盘退变[13]，易于操作、结构单一且术中创伤性小，实验动物存活率高，使得大鼠尾椎成为研究椎间盘退变的理想模型[14]。目前椎间盘退变模型选择多样，诸如机械损伤模型、应力改变模型、敲除特定基因模型、自发性椎间盘退变模型等[15]。团队前期尝试自发性椎间盘退变模型(截取前肢后悬吊模型)[16]，但其退变周期难以估计，导致实施相对困难。机械损伤模型因其操作的简便性得以广泛使用，在工具选择上退变最为明显的为18 G针头[17]，造模所需周期可为1周[18]；不同大鼠的选择上[19]，老年雌性大鼠造模退变较为明显[20]；另外，造模上穿刺与无水乙醇等的联合运用可使得造模成功率增高[9]；在退变工具上不乏有专利的设计[21]，但专利因为其不可获得性，导致模型无法复制。虽然机械损伤模型运用广泛，如研究艾灸对腰椎间盘退变的影响[22]，但机械损伤模型的穿刺大部分为非引导下穿刺，不利于机械损伤的准确实施，作者在前期造模研究上也多次缺乏影像学的引导，导致造模失败。因此综上，此次实验选用老年雌鼠，机械损伤上选择退变最为明显的18 G针头，加注射无水乙醇增强造模的成功率[9]，可以精准穿刺造模且加速退变。

在检测指标方面，苏木精-伊红染色是大多数组织病理学诊断的金标准，有荧光显微镜、光声遥感和散射显微镜等先进技术[23-24]，在椎间盘退变的相关研究，如椎间盘退变与铁过载[25]、椎间盘退变与Nrf2/NF-κB等信号通路的相关联系中应用广泛[26]。此次实验采用苏木精-伊红染色能较好反映椎间盘退变的病理学变化。白荣飞等[27]运用针刺椎间盘联合终板注射法诱导椎间盘退变，发现该造模方法能加快椎间盘退变模型；HAN等[28]较早提出利用尾椎进行模拟椎间盘退变模型，然而白荣飞等与HAN等选择的影像学观察均为X射线片，具体测量为X射线片上观察椎间隙变窄、上下终板骨质硬化、椎体边缘骨赘形成，未能直观观察椎间盘退变情况及分级。而MRI影像学可直观观察，LI等[29]为研究模拟失重条件下肿瘤抑制蛋白p53、p16及炎性因子表达水平与大鼠腰椎间盘退变程度的关系，实验组大鼠MRI显示椎间盘明显损伤，更加直观地验证了病理学检测结果。所以，在MRI影像下可以更加清晰直观地看到组织的具体情况[30-32]，不论是在哪种动物(大鼠、兔子等)上均为如此。有研究在制作椎间盘相关模型时更建议使用MRI而非X射线片进行模型的评估，因为由于大鼠的腰椎间盘高度太小，无法通过X射线片摄影准确测量，而且容易受到体位和肌肉松弛程度的影响，这可能与纤维环的变化相关[33-34]，并且MRI对于椎间盘退变的敏感程度较X射线更高[35]。此次实验选用MRI作为影像学检查可更加直观地显示椎间盘退变情况。

在造模方法选用方面，FERNÁNDEZ-SUSAVILA等[36]研发一种可能较为符合人体退变的规律，即将椎体终板的血管分离，导致椎间盘血供较差，椎间盘可逐步退变，相比此次联合造模方式，该造模操作较为精细，需要在大鼠尾椎终板开精密钻孔并形成裂口，阻止血液供应于椎间盘；相比于该造模方案，此次实验方案操作便捷、可复制性强，未来再进一步加强与人体退变规律相近的联系，以复制椎间盘退变模型，更好地反映人体椎间盘退变的机制。同时，JI等[37]开发椎体静态加压装置，观察静态弯曲和加压后椎间盘的形态学和生物学变化，当实验组和对照组分别加压到1.8，4.5 N时，MRI、组织学和qRT-PCR分析显示出退变相似的结果，静态弯曲和压缩均可诱导椎间盘退变，可用于复杂静态载荷促进椎间盘退变的生物学研究，然而合适的力学未明确，具体的最佳干预时间也有待进一步研究。XIA等[38]应用力学实验模拟大鼠腰椎前凸，评价不同程度压迫诱导椎间盘退行性改变的效果，随着负荷强度的增加，静态压缩在T2加权MRI上产生了显著的渐进式成像强度降低，7.2 N左右退变较重，不同应力引起退变的过程不同，随着应力的增加，凹型椎间盘退变越严重，然而其研究较为初步，仍有待进一步研究具体的压力与腰椎前凸程度之间的联系。而此次实验选用针刺方案已经有较多前期研究，是椎间盘退变较为成熟的造模方法。

近年来团队主要从事正骨推拿治疗椎间盘退变等相关研究，并逐步以此为中心开展相关动物实验及循证医学研究。在人体力学方面，由于人体正常生理活动中各节段椎间盘起主要的承重和传导负荷作用，其中以腰椎间盘所接受轴向压缩作用力最大[39]。但目前对腰椎间盘的病理生理研究多从椎间盘退变及其机制着手，多数腰部疾病与椎间盘退变造成的脊柱生物力学改变关系密切，而异常力学负荷是椎间盘退变的主要因素之一，脊柱力学及相关基础实验有待进一步挖掘[39-40]。所以作者所在团队前期结合腰椎间盘退变模式及相关通路对这一研究热点进行探讨，以期为后续推拿临床试验、动物研究提供参考及理论支持[41]。而在动物实验方面，既往动物研究的长河中，其提供了人类从宏观到微观的研究方式，遵循3R(替换、优化、减少)原则，并逐步设立动物护理和使用委员会(IACUC)、设立ARRIVE指南等规则以保证动物实验质量[42-44]。显现出动物循证医学的高级别证据，如针刺治疗高血压的动物实验Meta分析[45]，为此进行动物实验是人们了解椎间盘从人体宏观到微观的探索，作者所在团队拟在之后的研究中加入推拿干预以观察其椎间盘的变化，承载循证医学研究，近年来发表在生物医学期刊的动物实验文章数量急剧增加，但越来越多的研究发现，文章的方法学及报告质量不尽如人意[46]。目前主要以SYRCLE动物实验风险评估工具[47]、GSPC清单(Gold Standard Publication Checklist)[48]、ARRIVE指南(Animal Research: Reporting In Vivo Experiments guidelines)为代表的循证医学工具逐步被应用于动物实验的相关领域[49]，故证据使用者得以充分了解其实验设计和实施的全过程，在一定程度上有助于其成果的转化和利用。作者所在团队将在未来的研究中积极按照上述循证医学工具中的要求，切实有效地指导动物实验的设计、实施与报告，以期提升文章整体质量并保证实验的可重复性。

实验存在以下局限性：①未从细胞层面对相关因子及蛋白进行检验；②大鼠的神经节细胞主要由脊索细胞组成，在细胞营养、分化和再生方面可能与人类不同，未来需进一步摸清两者的联系，做出更贴近人体退变的动物模型。

综上所述，在X射线引导下针刺联合无水乙醇法可明显加重椎间盘退变过程，相对于无X射线引导联合无水乙醇法可精确控制针刺位置及深度，精准方便且造模方法退变明显，可为研究椎间盘退变模型的建立提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
椎间盘退变：是指由于年龄增长，椎间盘失去水分和出现纤维性变而变形，加之椎间盘自身可能缺乏血供或劳损不稳定，发生退行性变。
X射线：是一种频率极高、波长极短、能量很大的电磁波，频率范围30 PHz-300 EHz，其具有穿透性，但人体组织间有密度和厚度的差异，当X射线透过人体不同组织时被吸收的程度不同，经过显像处理后即可得到不同的影像。

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实验将9只SD大鼠随机分为3组，除空白组无任何操作外，其余两组分别在X射线下或非X射线下穿刺进行椎间盘退变模型的制作，并在术后1周行 MRI及苏木精-伊红染色检查，结果显示非X射线引导穿刺组、X射线引导穿刺组均能导致退变，而X射线引导穿刺组可出现明显椎间盘退变，且操作更加精准。通过对比X射线引导下、非X射线引导下大鼠椎间盘退变模型，前者模型退变明显、操作精准便捷，可为大鼠椎间盘模型的制作提供参考。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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