2.1   数据挖掘分析HDAC9在衰老骨髓间充质干细胞中的表达   通过数据挖掘、生物信息学对GEO数据中骨髓间充质干细胞衰老相关数据集GSE34303进行分析，结果显示细胞在衰老过程中，只有HDAC9 呈现高表达状态，见图1。



2.2   共表达分析   通过BRB-ArrayTools v4.2.0中 “create genelist”->“Correlated with a target gene”功能，发现与HDAC9共表达的基因有40个，均为正相关。进一步通过HAGR数据库，发现40个共表达的基因中有3个基因(ANGPTL4、PLAT、SCN9A)为衰老相关基因，见图1。
2.3   β-半乳糖甘酶染色结果    第10代骨髓间充质干细胞已经表现出了明显的衰老现象，β-半乳糖甘酶染色阳性细胞最为明显。为了进一步明确第10代骨髓间充质干细胞的衰老状态，对相关衰老基因的表达进行了检测，结果显示：与第5代比较，p16、p21及p53在第10代骨髓间充质干细胞中表现出高表达状态，差异有显著性意义，见图2。




2.4   qRT-PCR技术分析骨髓间充质干细胞衰老过程中HDAC9的表达   与GEO 数据库中的结果一致：在衰老时HDAC9呈现高表达状态，差异有显著性意义；Western blot检测结果与qRT-PCR结果一致，HDAC9蛋白在衰老的骨髓间充质干细胞中表达增加，见图2。
2.5   免疫荧光检测HDAC9在衰老及年轻骨髓间充质干细胞中的表达   HDAC9在年轻骨髓间充质干细胞的胞核与胞浆中均有表达，但HDAC9在胞核中的表达低于衰老细胞。衰老骨髓间充质干细胞的胞浆中几乎不表达HDAC9，而细胞核中的表达增加，见图3。

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骨髓间充质干细胞是一种具有高度增殖、自我复制和多向分化潜能的干细胞[1]。在口腔颌面部发育畸形矫正、慢性牙周炎治疗、创伤及肿瘤等原因造成的各种口腔颌面部大面积软硬组织缺损修复上，骨髓间充质干细胞具有重要的作用和广阔的临床应用前景[2-3]。然而骨髓间充质干细胞并非是“长生不老”的细胞，不管是随着年龄的增长还是在体外培养体系中，骨髓间充质干细胞都会逐渐衰老。衰老的骨髓间充质干细胞会出现细胞形态改变(如体积变大、扁平化等)、亚细胞结构变异(如端粒变短等)、多向分化能力丧失(如自我更新和多向分化能力明显下降、增殖分化失控等)[4]，这极大影响了其在实际临床治疗中的作用[5]。骨髓间充质干细胞在衰老过程中，可引起干细胞潜能性降低[6]，其维持细胞干性的基因如Oct4、Sox2、Nanog 等表达下调，而衰老相关的基因如p16、p21、p53等表达上调[7]。表观遗传作用机制在基因表达调控方面具有重要的作用，其主要是通过调控染色质的状态改变DNA与组蛋白的结构[8]，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDACs)被认为是基因表达的抑制因子，其可以使组蛋白脱乙酰化而使染色质处于浓缩状态，进一步关闭基因[9]。HDACs活性对于上述干性基因以及衰老相关基因、端粒酶均有调控作用[10-11]。一些抗衰老的药物研发也是通过探究HDACs抑制剂来实现的[12]；目前已发现HDACs亚型有11个(HDAC1-11)，HADCs在进化上比较保守，根据其DNA序列的相似性，经典的HDACs(1-11)可以将其分为3类，class Ⅰ(HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8)，ClassⅡ(HDAC5、HDAC9、HDAC6、HDAC10)；ClassⅣ(HDAC11)，而较特殊的ClassⅢ类主要是由sirtuins家族组成[13]，探究出哪一种HDACs在骨髓间充质干细胞衰老过程中发挥关键作用，对于研发预防骨髓间充质干细胞衰老的相关药物，将有着重要的实际意义。该研究主要是通过生物信息学及相关分子生物学技术分析骨髓间充质干细胞衰老过程中HDAC9的表达。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   细胞体外实验，组间均数比较采用t检验分析。
1.2   时间及地点   实验于2019年10月至2021年9月在黑龙江省硬组织发育与再生重点实验室完成。
1.3   材料   大鼠骨髓间充质干细胞株购买自赛业生物科技有限公司，货号：RASMX-01001，已有质检报告。DMEM培养基(货号：RAXMX-90011，赛业生物科技有限公司)；TRIZOL(Invitrogen公司，美国，货号：15596026)；PrimeScript RT master mix (TaKaRa 公司，日本，货号：DRR047A)；SYBR Premix EX TaqTM Ⅱ (TaKaRa公司，日本，货号：DRR420A)。
1.4   实验方法   
1.4.1   基因表达谱数据分析   GSE34303取自于基因表达谱数据库(GEO)[14-15]。该数据比较了不同传代次数后衰老骨髓间充质干细胞的转录组。为了明确衰老组与年轻组之间的差异，该研究选其passage2/3与passage10/11进行分析。差异表达基因分析：利用BRB-ArrayTools v4.2.0中的RMA(robust multi-array analysis)方法对于原始数据进行标准化和归一化处理[16]，用其中附带的SAM(significant analysis of microarrays)方法分析差异表达基因，并确认其中HDACs的表达，设置假发现率(FDR) < 0.05。
1.4.2   挖掘与HDAC9共表达(co-expression)的基因   通过BRB-ArrayTools v4.2.0中“create genelist”->“Correlated with a target gene”功能，筛选与HDAC9共表达的基因，为了结果的可靠性，选取其相关系数≥0.5(正相关)或< -0.5(负相关)。进一步通过人类衰老基因组数据库(human ageing genomic resources，HAGR)来确认共表达基因中是否含有衰老相关的基因[17]。
1.4.3   β-半乳糖甘酶染色   将年轻的大鼠骨髓间充质干细胞(第5代，p5)及衰老的大鼠骨髓间充质干细胞(第10代，p10)按照5×104个/孔均匀接种到6孔板中，置于37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱培养48 h后，吸除细胞培养液，PBS洗涤1次，加入1 mL β-半乳糖甘酶染色固定液，室温固定1 h，吸除固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min，吸尽PBS后每孔加入1 mL染色工作液，避光于37 ℃摇床上缓慢摇晃孵育过夜，次日在光学显微镜下观察其变成蓝色的细胞数目。
1.4.4   Real-time PCR检测衰老相关基因表达   取年轻的大鼠骨髓间充质干细胞(第5代)及衰老的大鼠骨髓间充质干细胞(第10代)，置于37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱培养。当细胞融合度达到80%时进行消化，然后将消化下来的细胞以5×104个/孔的细胞密度接种在6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，置于37 ℃体积分数为5% CO2培养箱中培养48 h，采取Trizol法提取细胞总RNA，严格按照SYBR®Premix Ex TaqTM(DRR047A)说明书进行。预变性：95 ℃ 30 s，1 Cycle；PCR 反应：95 ℃ 5 s，60 ℃20 s，40 Cycles；熔解曲线：95 ℃ 30 s，65-90 ℃ 1 s。以GAPDH为管家基因，采用2-ΔΔCt法分析各组衰老基因(p16、p21及p53)表达的相对差异。基因引物序列，见表1。

1.4.5   Western blot及免疫荧光染色检测HDAC9的表达   将年轻(第5代)及衰老(第10代)的大鼠骨髓间充质干细胞按照5×104个/孔的细胞密度接种在6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，置于37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱中进行培养。培养24 h后提取总蛋白，每孔加入60 μL RIPA-PMSF裂解液进行细胞裂解，用细胞刮板将含有裂解液的细胞整体小心刮下，用移液器将全部“细胞-蛋白混合液”移至EP管中，置冰上裂解20 min，期间每隔5 min进行充分涡旋1次，共4次；裂解充分后，于4 ℃、13 000 r/min离心20 min；吸取上清液(即为所提取蛋白样品)至新的EP管，采用BCA法进行蛋白浓度测定；配SDS-PAGE胶，电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入稀释好的一抗HDAC9(Abcam公司，货号ab109446，1∶1 000)，4 ℃孵育过夜；脱色摇床TBST漂洗3次，每次5 min，加入稀释好的二抗，混匀，孵育1 h，脱色摇床TBST漂洗3次，每次5 min；最后用ECL显色液显影，应用化学发光成像系统成像拍照。
将年轻的大鼠骨髓间充质干细胞(第5代)及衰老的大鼠骨髓间充质干细胞(第10代)按照2×104个/孔的细胞密度接种于含有细胞玻片的24孔板中培养24 h，40 g/L多聚甲醛(pH=7.4)固定，去除固定液，PBS洗涤，每孔加入2 mL 0.5%Triton X-100，冰上孵育15 min，去除0.5%Triton X-100， PBS洗涤3次，每次2 min，用封闭液封闭60 min，去除封闭液，加入稀释好的HDAC9(Abcam公司，货号ab109446)一抗(1∶400)，4 ℃孵育过夜，去除一抗，PBS洗涤，加入稀释好的荧光标记的二抗，避光孵育60 min，滴加防淬灭剂，封固，荧光显微镜下观察。
1.5   主要观察指标   ①高通量数据GSE34303中HDAC9的表达；②骨髓间充质干细胞衰老后β-半乳糖甘酶染色以及衰老基因p16、p21、p53的表达；③HDAC9基因及蛋白在年轻(第5代)及衰老(第10代)骨髓间充质干细胞的表达。
1.6   统计学分析   采用 Prism 6统计软件进行数据分析，组间均数比较采用t检验分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

骨髓间充质干细胞由于其在体外易于获得和分离、具有自我更新、多向分化能力和低免疫原性，目前已经成为细胞治疗领域极具吸引力的种子细胞之一，有望成为细胞治疗和再生医学的重要资源[1，18]。然而骨髓间充质干细胞在体外培养过程中由于其传代所造成的衰老问题，为其临床应用增加了难度和不确定因素，这些均是影响其临床应用的关键问题之一。有研究结果显示：骨髓间充质干细胞自然传代至第7-10代时，即出现细胞衰老的表征，细胞体积逐代增大，胞质铺开，形态变得扁平，生长速度减慢；β-半乳糖苷酶染色阳性率开始增多[19-20]，提示骨髓间充质干细胞在体外增殖过程中发生衰老，细胞传代越多，衰老越明显。该研究将骨髓间充质干细胞传至10代时表现出较明显的衰老现象，与以往研究较为一致。

以往研究认为表观遗调控机制在干细胞衰老方面有着重要的作用[21]。HDACs主要通过影响染色质的结构及转录因子的活性来调控基因的转录过程，起到基因表达沉默的作用[22]。多种HDACs 在衰老过程中有着不同的表达模式[23]，其中最具代表性的为HDACs第二亚类(Ⅱa)HDAC9，其在衰老的肌肉细胞[24]、成纤维细胞中都有异常表达[25]，在干细胞分化过程中其还可以负向调控成脂分化，影响端粒的长短[26]。另有研究显示下调HDAC9的表达将会导致骨髓间充质干细胞的成骨偶联成血管分化能力降低，成脂分化能力增强[27]。课题组前期也发现在骨髓间充质干细胞成脂过程中阿司匹林可以影响HDAC9的表达[28]。

为了进一步明确HDAC9 在骨髓间充质干细胞衰老过程中的表达，通过生物信息学及实验验证发现，细胞衰老后HDAC9呈现高表达状态，且其在衰老的骨髓间充质干细胞中呈现出不同的表达模式，HDAC9 在年轻骨髓间充质干细胞的细胞核与细胞浆中均有表达，而当细胞衰老时，HDAC9 在细胞浆中的表达降低，而细胞核中的表达增强。虽然通过生物信息技术对高通量数据GSE34303挖掘后，发现衰老的骨髓间充质干细胞中，仅有HDAC9呈现出差异表达，但是通过qRT-PCR进行验证后其他HDACs亚型也有不同程度的差异表达，前期发现阿司匹林可以逆转骨髓间充质干细胞的衰老，且在成脂分化过程中可以影响HDAC9的表达[28]，因此该研究重点关注了HDAC9，后期对于其他HDACs亚型的表达模式还需进一步研究。

有研究显示在炎症微环境状态下，牙周膜干细胞中HDAC9的表达也呈现高表达状态[29]。另外，抑制HDAC9的表达后可以促进成骨分化而抑制成脂分化，重要的是，抑制HDAC9后可以改变衰老蛋白P53的表达及磷酸化水平[29]，结合该研究HDAC9在衰老干细胞中的表达模式，进一步提示HDAC9在干细胞功能中具有重要的作用，但其衰老表型与HDAC9发挥作用的分子机制尚待进一步研究。研究结果显示HDAC9可以通过调节PPARγ/RANKL信号抑制破骨细胞形成[30]。ZHANG等[29]研究发现HDAC9在小鼠增龄相关的骨流失过程中，其骨髓及骨髓间充质干细胞中的HDAC9呈高表达状态，与此研究结果相一致。CHEN等[31]研究结果显示EZH2(enhancer of zeste homolog 2)可以通过下调HDAC9的表达进而调控衰老干细胞的成骨及成脂分化。另外HDAC9在成骨及炎症状态的牙周膜干细胞中也具有重要的作用，如LI等[32]研究表明，HDAC9与miR-17相互作用可以调控炎症状态下人牙周膜干细胞的成骨分化。HDAC9除了在干细胞方面的研究外，其还可以调控巨噬细胞M2的极化状态[33]，衰老可以导致巨噬细胞从抗炎的M2型转换为促炎的M1型[34]，那么在上述衰老及炎性状态下的干细胞中，HDAC9是否参与了调控巨噬细胞的M1/M2极化，有待进一步研究。
研究发现，与HDAC9共表达的40个基因中，有3个基因ANGPTL4、PLAT、SCN9A为衰老基因，ANGPTL4(血管生成素样蛋白4)在间充质干细胞复制性衰老过程中表达下调[35]，PLAT基因的多态性与衰老相关[36]，SCN9A在癌基因诱导的细胞衰老中呈高表达状态，而SCN9A缺失的情况下，细胞则不出现衰老状态[37]，这些也从侧面提示HDAC9与衰老的发生、发展有着重要的作用。

综上所述，该研究初步验证了HDAC9在骨髓间充质干细胞自然衰老中呈现高表达状态，该结果为下一步研究其在骨髓间充质干细胞衰老过程中的作用机制奠定基础，也为进一步筛选新的延缓骨髓间充质干细胞衰老药物靶点提供参考，对于推动干细胞临床应用具有重要意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
骨髓间充质干细胞：是再生医学领域中重要的种子细胞，骨髓间充质干细胞自然传代至第7-10代时，即出现细胞衰老的表征，极大地影响了其临床转化应用。
组蛋白去乙酰化酶：是基因表达的抑制因子，主要是因为组蛋白去乙酰化酶可以使组蛋白脱乙酰化而使染色质处于浓缩状态，进一步关闭基因。组蛋白去乙酰化酶活性对衰老相关的基因、端粒酶均有调控作用，明确组蛋白去乙酰化酶亚型对于研发抗骨髓间充质干细胞衰老的药物有着重要意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)在干细胞衰老方面一直是研究热点，有研究显示HDACs(HDAC2、HDAC6、HDAC8、HDAC9；Sirt4)在精原干细胞衰老过程中有着重要作用，也有研究显示HDACs可以通过平衡polycomb基因及JMJD3来调控成体干细胞的衰老；而抑制HDACs的活性还可以影响人脐血干细胞的衰老；另外HDACs相关抑制剂可以有望用来抗衰老治疗；HDAC9在骨髓间充质干细胞中的研究还比较少，现有研究多关注于其对于干细胞的成骨分化。阐明HDAC9在内的多种HDACs亚型对于骨髓间充质干细胞分化及衰老的具体作用机制，对于研发新的延缓骨髓间充质干细胞衰老的药物将有重要的实际意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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