白细胞介素27参与了腰椎间盘突出症的病理过程

doi:10.12307/2022.678

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (23): 3750-3755.doi: 10.12307/2022.678

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白细胞介素27参与了腰椎间盘突出症的病理过程

薛华伟1，2，朱敏1，2，李玉前1，2

1南通市第三人民医院骨科，江苏省南通市 226000；2南通大学医学院，江苏省南通市 226000

收稿日期:2021-05-06 接受日期:2021-06-24 出版日期:2022-08-18 发布日期:2022-02-12
通讯作者: 李玉前，硕士，主任医师，副教授，南通市第三人民医院骨科，江苏省南通市 226000；南通大学医学院，江苏省南通市 226000
作者简介:薛华伟，男，1983年生，江苏省东台市人，汉族，2015年南通大学毕业，硕士，副主任医师，主要从事脊柱外科研究。
基金资助:
南通市卫生和计划生育委员会科研课题(WKZL2018065)，项目负责人：薛华伟

Interleukin-27 is associated with the pathogenesis of lumbar disc herniation

Xue Huawei1, 2, Zhu Min1, 2, Li Yuqian1, 2

1Department of Orthopedics, the Third People’s Hospital of Nantong, Nantong 226000, Jiangsu Province, China; 2Nantong University School of Medicine, Nantong 226000, Jiangsu Province, China

Received:2021-05-06 Accepted:2021-06-24 Online:2022-08-18 Published:2022-02-12
Contact: Li Yuqian, Master, Chief physician, Associate professor, Department of Orthopedics, the Third People’s Hospital of Nantong, Nantong University, Nantong 226000, Jiangsu Province, China
About author:Xue Huawei, Master, Associate chief physician, Department of Orthopedics, the Third People’s Hospital of Nantong, Nantong University, Nantong 226000, Jiangsu Provence, China
Supported by:
the Research project of Nantong Health and Family Planning Commission, No. WKZL2018065 (to XHW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
白细胞介素27：是一种新的白细胞介素12家族细胞因子，与白细胞介素12、白细胞介素23和白细胞介素35共同组成了白细胞介素12细胞因子家族。白细胞介素27是由EBI3(与白细胞介素12 p40亚基同源)和p28(与白细胞介素12p35亚基同源)两条链通过二硫键连接构成的异源二聚体，在结构上与其他成员具有高度的相似性。白细胞介素27由活化的抗原呈递细胞即单核巨噬细胞和树突状细胞产生，通过表达在T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞和内皮细胞上的白细胞介素27受体(白细胞介素27受体)发挥作用。
腰椎间盘突出症：腰椎间盘发生退行性改变，在外力作用下，纤维环部分或者全部破裂，单独或者连同髓核软骨终板向外突出，刺激压迫窦椎神经和神经根引起的以腰腿痛为主要症状的一种病变。

背景：炎症是腰椎间盘突出症发生的重要机制，Th17细胞在免疫激活中起着关键作用。白细胞介素27可以通过下调白细胞介素6和转化生长因子β的表达抑制Th17细胞分化，在多种自身免疫性疾病中发挥重要作用，然而人们对白细胞介素27和腰椎间盘突出症之间的关系知之甚少。
目的：检测腰椎间盘突出症患者血液及髓核中白细胞介素27表达情况，探讨它与腰椎间盘突出症的关系。
方法：选择腰椎间盘突出症患者36例，健康志愿者18例，急诊手术的腰椎爆裂性骨折患者8例。腰椎间盘突出症患者行开窗髓核摘除、腰椎后路椎间融合器融合或经椎间孔椎间融合器融合手术，术前使用目测类比评分法评估患者的疼痛强度。取腰椎间盘突出症患者与健康志愿者血液样本，ELISA法检测术前外周血血清白细胞介素27、白细胞介素17表达情况；取腰椎间盘突出症患者髓核样本与腰椎爆裂性骨折患者的髓核样本(视为正常髓核样本)，qRT-PCR与Western blot测定髓核组织中白细胞介素27、白细胞介素17 mRNA及蛋白的表达情况。
结果与结论：①腰椎间盘突出症患者血清的白细胞介素27表达水平显著高于健康对照组(P < 0.001)；白细胞介素17在腰椎间盘突出症患者血清中的表达水平也明显升高；②在蛋白水平，腰椎间盘突出症患者髓核中的白细胞介素27及白细胞介素17表达水平明显高于正常髓核(P < 0.001)；③在mRNA水平，腰椎间盘突出症患者髓核中白细胞介素27及白细胞介素17表达水平明显高于正常髓核(P < 0.001)；④轻度疼痛患者白细胞介素27表达水平高于重度疼痛患者(P < 0.01)；⑤提示炎症是腰椎间盘突出症患者疼痛的原因，白细胞介素27参与了腰椎间盘突出症的病理过程。

https://orcid.org/0000-0002-6197-1578 (李玉前)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 白细胞介素27, 白细胞介素17, 腰椎间盘突出症, 血液, 髓核, 椎间盘

Abstract: BACKGROUND: Inflammation is an important mechanism underlying lumbar disc herniation. Th17 cells play a key role in immune activation. Interleukin-27 can inhibit Th17 cell differentiation by down-regulating the expression of interleukin-6 and transforming growth factor-β, and plays an important role in a variety of autoimmune diseases. However, little is known about the relationship between interleukin-27 and lumbar disc herniation.
OBJECTIVE: To investigate the levels of interleukin-27 in patients with lumbar disc herniation, and to explore their association with lumbar intervertebral disc herniation.
METHODS: This study enrolled 36 patients with lumbar disc herniation, 18 healthy controls, and 8 patients undergoing emergency surgery for thoracolumbar burst fracture. Patients with lumbar disc herniation received posterior fenestration discectomy, posterior lumbar interbody fusion (PLIF) or transforaminal lumbar interbody fusion. The pain intensity of the patients was scored using a visual analogue scale (VAS) before operation. Serum interleukin-27 and interleukin-17 levels in peripheral blood were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Samples of nucleus pulposus from patients with lumbar disc herniation and those with thoracolumbar burst fractures (considered as normal nucleus pulposus samples) were taken for detection of interleukin-27 and interleukin-17 mRNA and protein using quantitative real-time PCR and western blot assay, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Patients with lumbar disc herniation had significantly higher serum interleukin-27 levels than healthy controls (P < 0.001). Interleukin-17 levels were also significantly higher in the patients with lumbar disc herniation. The protein and mRNA expression levels of interleukin-27 and interleukin-17 in the nucleus pulposus were significantly higher in patients with lumbar disc herniation than patients with thoracolumbar burst fractures (P < 0.001). The expression of interleukin-27 was significantly higher in patients with mild pain than those with severe pain (P < 0.01). To conclude, inflammation is responsible for the pain experienced by patients with lumbar disc herniation, and interleukin-27 is involved in the pathogenesis of lumbar disc herniation.

Key words: interleukin-27, interleukin-17, lumbar disc herniation, blood, nucleus pulposus, intervertebral disc

中图分类号:

薛华伟, 朱敏, 李玉前. 白细胞介素27参与了腰椎间盘突出症的病理过程[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3750-3755.

Xue Huawei, Zhu Min, Li Yuqian. Interleukin-27 is associated with the pathogenesis of lumbar disc herniation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(23): 3750-3755.

图/表（结果） 4

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引言

腰椎间盘突出症是目前成年人的一种多发病，男性多于女性，据报道人群中发病率为5%-10%，主要表现为下腰痛或者坐骨神经痛，严重者出现马尾症状，甚至会有尿便功能障碍。随着电子产品的普及、生活方式的改变，腰椎间盘突出症的发病率还在增加，随之带来的腰腿痛已经严重影响了人们的工作和生活，也给社会带来了沉重的经济负担。大多数腰痛与坐骨神经痛，特别是纤维环破裂和髓核突出的患者，都与退变有关[1-2]。据报道，当脊髓神经根受压迫时，患者主要表现为麻木，而不是疼痛，炎症是腰腿痛的主要原因[3]。
近些年来，有关腰椎椎间盘疾病发病机制的研究越来越多地集中在炎症和免疫方面。细胞因子白细胞介素1和肿瘤坏死因子α在退变的椎间盘组织中高表达[4-5]。在疼痛的腰椎间盘突出症患者椎间盘组织中，白细胞介素1表达水平显著升高[6]。磷脂酶A2与腰椎间盘突出症的疼痛有关，它是前列腺素E和白细胞介素生成的限速步骤[7]。突出的腰椎间盘髓中前列腺素E2升高，且与疼痛产生相关联[8]。KARPPINEN等[9]的研究已表明，白细胞介素6与坐骨神经痛相关。Th17淋巴细胞和白细胞介素17表达水平的增加引起了腰椎间盘突出症患者的疼痛[10]。白细胞介素21通过自分泌的方式扩增Th17，促进白细胞介素17的表达，参与腰椎间盘突出症疼痛的病理过程[11]。白细胞介素23通过白细胞介素23/Th17轴参与腰椎间盘突出症的病理过程[12]。
Th17细胞是一种新发现的淋巴细胞类型，其主要效应细胞因子为白细胞介素17。白细胞介素17是一种促炎细胞因子，最初发现由Th17细胞分泌，在许多炎症和自身免疫相关疾病中发挥重要作用。Th17淋巴细胞和白细胞介素17水平的升高与腰椎间盘突出症患者的疼痛有关[10]。
白细胞介素27是2002年6月美国DNAX研究所的PFLANZ等[13]发现并命名的一种新的白细胞介素12家族细胞因子，与白细胞介素12、白细胞介素23和白细胞介素35共同组成了白细胞介素12 细胞因子家族。白细胞介素27由EBI3(与白细胞介素12 p40亚基同源)和p28(与白细胞介素12p35亚基同源)两条链通过二硫键连接构成的异源二聚体，在结构上与其他成员具有高度的相似性。白细胞介素27由活化的抗原提成细胞即单核巨噬细胞和树突状细胞产生，通过表达在T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、肥大细胞和内皮细胞上的白细胞介素27受体发挥作用[14]。白细胞介素27通过下调白细胞介素6和转化生长因子β的表达抑制Th17细胞分化，导致白细胞介素17表达减少[15]，白细胞介素27还通过下调转录因子GATA-3表达抑制Th2细胞分化[16]。
白细胞介素27在多种自身性免疫性疾病的病理过程中起重要作用，比如说类风湿性关节炎、多发性硬化、结肠炎(包括克罗恩病与溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、牛皮癣、1型糖尿病[17-22]。白细胞介素27作为重要的免疫调节剂，参与了多种自身免疫性疾病的病理过程，然而它在腰椎间盘突出症中的功能及相关机制尚不清楚。此次研究目的是探讨腰椎间盘突出症患者的白细胞介素27表达情况，并探索它与腰椎间盘突出症的相关关系。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计免疫学实验，样本均数间的比较先做正态性与方差齐性检验，如果条件满足用t检验，如果条件不满足用t′检验。
1.2 时间及地点实验于2017年12月至2020年6月在南通市第三人民医院完成。
1.3 对象选择2017年12月至2019年12月南通市第三人民医院脊柱外科收治的腰椎间盘突出症患者36例，健康成年志愿者18例。腰椎间盘突出症患者要求为单节段，有典型下腰痛或坐骨神经痛，直腿抬高实验阳性，典型MRI和CT表现，没有钙化征象。
患者与健康志愿者的排除标准：①有骨关节炎、峡部裂、腰椎滑脱、急慢性炎性疾病、代谢疾病、自身免疫性疾病史、肿瘤、高血压或糖尿病病史者；②曾服用或正在服用免疫抑制药物者；③有腰椎退变性疾病手术史者。所有药物，包括非类固醇抗炎药和激素，在血液样本收集和手术前2周全部停用。

选择8例急诊减压手术的腰椎爆裂性骨折患者，术中取髓核作为正常髓核对照。这些患者既往没有腰痛或坐骨神经痛病史，经MRI证实椎间盘无退变，未受到外伤破坏，无免疫系统疾病史，无急性或慢性炎症、代谢性疾病或者肿瘤病史。所有患者和健康对照者均签署知情书。此次研究通过南通市第三人民医院伦理委员会同意。患者特征见表1。

在手术当天清晨，使用目测类比评分记录疼痛强度，将腰椎间盘突出症患者分为轻度疼痛(1-3分)、中度疼痛(4-6分)、重度疼痛(7-10分)；同时抽取腰椎间盘突出症患者5 mL的空腹血，使用肝素钠抗凝管保存；抽取健康志愿者5 mL的空腹血液作为对照。血液样本经过离心后取上清，放置在一个无菌的低温储藏管内。腰椎间盘突出症患者接受后路开窗髓核摘除术，或行腰椎后路椎间植骨融合术、经椎间孔腰椎椎体间植骨融合术。髓核摘除后，标本放置在一个无菌的低温储藏管内。所有标本-80 ℃保存。
1.4 实验试剂和仪器人白细胞介素27定量ELISA试剂盒(Abcam公司)；人白细胞介素17定量ELISA试剂盒(Abcam公司)；白细胞介素27/白细胞介素17兔抗人多克隆抗体(Abcam公司)； ACTIN(Sangong Biotech)；酶标仪(美国BIO-RAD公司)；反转录试剂盒(TOYOBO 公司)；全自动蛋白质核酸定量仪(Eppendorff公司)；荧光倒置显微镜(德国LEICA公司)；实时荧光定量PCR系统(ABI公司)；qRT-PCR仪(MJ RESEARCH公司)；Western Blotting装置(Bio-Rad公司)等。
1.5 方法
1.5.1 ELISA法检测血清白细胞介素27、白细胞介素17表达将稀释的单克隆抗体加入96孔聚苯乙烯板反应孔中，4 ℃孵育过夜。将反应孔中液体倒出，用洗涤缓冲液冲洗聚苯乙烯板5次。在室温下用封闭液孵育1 h之后，加入稀释检测样本于反应孔中(包括空白对照、阳性对照、阴性对照)。加入稀释的酶标抗体，在室温下孵育1 h。洗涤5次，加入底物溶液，在室温下反应30 min，加硫酸终止反应。读出各吸光度值，绘制出标准曲线，得出白细胞介素27、白细胞介素17质量浓度。
1.5.2 qRT-PCR检测髓核组织中白细胞介素27、白细胞介素17 mRNA表达
(1)提取组织RNA：取100 mg髓核组织加入1.5 mL离心管中。加TRIzol，匀浆，静置5 min。再加入0.2 mL氯仿，上下颠倒振荡15 s，静置2 min。4 ℃，12 000 r/min离心15 min，取上清。将0.5 mL异丙醇加入管中，轻轻混匀，在室温下静置10 min。4 ℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清。将1 mL 体积分数75%乙醇加入管中，轻轻洗涤，4 ℃，离心，弃上清。晾干，然后加入30 μL DEPC水溶解，65 ℃促溶15 min。紫外分光光度计定量后，PCR检测转录。
(2)qRT-PCR检测：①反转录反应(RT)：取总RNA 5 μL， DEPC处理过的水6 μL，oligodT 1 μL。70 ℃变性5min。立即冰浴1 min，离心3-5 s。再加入反转录酶缓冲液，dNTP，RNase抑制剂，70 ℃反应5 min。立即冰浴加反转录酶，42℃反应1 h，70 ℃ 10 min，反应终止，-20 ℃保存备用。②PCR反应：取RT产物cDNA 2 μL，加入10×Taq 酶缓冲液2 μL，上游引物(10 mmol/L) 1 μL，下游引物(10 mmol/L) 1 μL，25 mmol/L dNTP 1.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.25 μL，MgCl2 1.5 μL，ddH2O补足体积25 μL。PCR 扩增条件： 94 ℃，5 min；94 ℃，45 s； 58 ℃，45 s；72 ℃，45 s；20个循环，然后72 ℃延伸10 min，结束反应，-20 ℃保存备用。③在PCR 反应曲线窗口中设定基线值与阈值，读取Ct值。计算各基因相对表达量，各组之间表达的相对差异用actin衡量。
1.5.3 Western blot法检测髓核组织中白细胞介素27、白细胞介素17蛋白表达
(1)蛋白提取：从-80 ℃冰箱取出髓核组织，称质量后放入离心管。加裂解液，复温30 min。将髓核组织碾磨碎，冰浴静置，离心，取上清。测浓度，分装，-80 ℃储存待用。
(2)SDS-PAGE凝胶电泳：蛋白定量后，按蛋白量/2×SDS上样缓冲液/DTT比例为4/5/1处理蛋白。沸水煮15 min，充分变性，离心，取上清。制备8%聚丙烯酰胺分离胶和聚丙烯酰胺浓缩胶。玻璃平板夹层中注入分离胶垂，凝胶约11 cm高，加入正丁醇1 cm厚。恒温箱37 ℃15 min，4 ℃过夜。倒去正丁醇，用ddH2O冲洗，滤纸吸水，在夹层顶部慢慢加入积层胶，然后插入Telfon梳子，在室温下聚合30 min。将凝胶板固定于电泳装置的缓冲液室，放入电泳槽中，用1×SDS电极缓冲液完全浸润。拔出梳子，加样孔用1×SDS电泳电极缓冲液冲洗，然后加样。通电源，60 V电泳至蛋白跑到分离胶，之后改为80 V直到电泳结束，分离蛋白。关电源，稍作整理后，取凝胶，除浓缩胶，放在转移液中以备检测。
(3)转膜：①转印夹层组装：阴极-Scotch-Brite(海绵垫)垫-与凝胶等大的滤纸-凝胶-预先在转移液中平衡过的PVDF膜-滤纸-Scotch-Brite垫-阳极。②把转印夹层放入转移槽，然后加入转移液，将转移槽按正确的极性方向放入电转膜仪中，然后接电源；冷却、用350 mA电转120 min；关电源，取转印膜，用丽春红染色1 min，用ddH2O脱色2 min。
(4)蛋白质免疫检测：PVDF膜放在TBST中，80 ℃，1 h，浸洗膜3次，在室温下封闭2 h；把封闭液倒出，膜浸洗3次。一抗稀释后，孵育转印膜，4 ℃过夜；用TBST洗膜5次；二抗稀释后，孵育转印膜，室温下2 h；用TBST洗膜6次；滴加Luminol Ecl Reagent，将PVDF膜倒扣PARAFilm膜上室温2 min；暗室中进行曝光，显影和定影；扫描图像并分析，测定灰度值。相同条件下实验重复3次。
1.6 主要观察指标 ELISA法检测腰椎间盘突出症患者与健康志愿者血清中白细胞介素27及白细胞介素17的表达情况；腰椎间盘突出症患者及腰椎爆裂性骨折患者取髓核，通过qRT-PCR与Western blot检测髓核组织中白细胞介素27及白细胞介素17的mRNA和蛋白表达情况；另外使用qRT-PCR检测不同疼痛强度腰椎间盘突出症患者髓核组织白细胞介素27与白细胞介素17 mRNA的表达情况。
1.7 统计学分析所有的样本数以x±s表示，样本均数间的比较先做正态性与方差齐性检验，如果条件满足用t检验，如果条件不满足用t′检验。所有检测结果使用SPSS 22.0进行统计分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

在此次研究中，通过检测腰椎间盘突出症患者和健康对照组外周血及椎间盘组织样本，分析白细胞介素27、白细胞介素17在腰椎间盘突出症中的作用。此次研究结果显示，腰椎间盘突出症患者的白细胞介素27表达水平高于健康对照组，说明白细胞介素27有可能参与了腰椎间盘突出症的发病机制。
机械压迫、脊柱不稳定和免疫激活是腰椎间盘突出症发生的3个传统机制[10]，但是前2个机制不能完全解释整个发病机制。MACNAB[23]指出炎症是引起疼痛的主要因素，髓核的突出导致了生化和免疫学因素介导的炎症，它决定神经根病的病理生理学[24]。在过去的几十年中，越来越多的注意力集中于炎症和免疫激活在腰椎椎间盘疾病发病机制中的作用，事实证明，自身免疫因素在椎间盘疾病相关的炎症和疼痛中发挥着重要作用[10，25-29]。
白细胞介素27是p28和Epstein-Barr病毒诱导基因3(EBI3)亚基的异二聚体，它的主要产生者是活化的抗原呈递细胞，包括树突状细胞和巨噬细胞[30]，通过白细胞介素27受体复合物(白细胞介素27受体α WSX-1和gp130亚基的异二聚体)发挥作用[31]，多种细胞(包括活化的B细胞、活化的内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、肥大细胞、单核细胞、T细胞、自然杀伤细胞)表达白细胞介素27受体[32-34]。Th17细胞及其效应因子白细胞介素17已被证明在椎间盘突出症患者中明显增高，髓核组织中Th17与白细胞介素17的增加引起了腰椎间盘突出症患者的疼痛，并且与疼痛程度呈正相关[10]。Th17细胞产生白细胞介素17，诱导炎性细胞因子如白细胞介素6、粒细胞集落刺激因子、前列腺素E2等的产生，从而增强炎症反应[35]，而白细胞介素27可以通过下调白细胞介素6和转化生长因子β的表达抑制Th17细胞分化，导致白细胞介素17表达减少[15]。
已有研究显示，白细胞介素27在多种自身性免疫性疾病病理过程中发挥重要的作用[17-22]。此次研究显示，与健康对照组相比，腰椎间盘突出症患者血清白细胞介素27和白细胞介素17表达水平增高，这意味着白细胞介素27有可能与腰椎间盘突出症的病理机制有关。作者下一步检测了髓核内白细胞介素27和白细胞介素17的表达情况，白细胞介素27和白细胞介素17表达均高于对照组，进一步证实了作者的观点，白细胞介素27可能参与了腰椎间盘突出症的病理过程。作者依据目测类比评分，将腰椎间盘突出症患者分为轻度、中度、重度疼痛，结果发现，严重疼痛组的白细胞介素17表达水平高，白细胞介素27表达水平低；而轻度疼痛组的白细胞介素17表达水平低，白细胞介素27表达水平高，可能因为白细胞介素27可以通过某种途径抑制Th17细胞分化，导致白细胞介素17表达减少。在SASAGURI等[36]的实验中，缺乏白细胞介素27或其受体WSX-1的小鼠自发地表现为慢性疼痛过敏，白细胞介素27的加入逆转了白细胞介素27缺陷小鼠的热敏感和机械敏感行为。据研究显示，白细胞介素27可以通过下调白细胞介素6和转化生长因子β的表达抑制Th17细胞分化，导致白细胞介素17的表达减少[15]。白细胞介素27能否抑制腰椎间盘突出症患者Th17主导的炎症从而缓解疼痛呢？
此项研究的结果是令人欣慰的，然而应该指出的是，此次研究有几个局限性：首先，研究所列入的样本量相对较小；另一方面，没有新鲜的尸体，所以没有完全正常的髓核标本，将需要急诊减压手术的腰椎骨折患者获取的髓核组织用作正常髓核对照；此外，炎症是一个复杂的过程，炎症细胞、细胞因子相互作用，相互影响，白细胞介素27对Th1型免疫反应有双重调节作用[37-44]，此次研究只是复杂炎症过程中的一部分，仍需要进一步深入研究。
结论：总而言之，此次结果表明，炎症是腰椎间盘突出症患者腰腿痛的重要原因，白细胞介素27表达参与了腰椎间盘突出症的病理过程，在腰椎间盘突出症的病理机制中发挥作用。这将来有可能会被用作新的医疗策略来缓解腰椎间盘源性疾病引起的腰腿疼痛。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

白细胞介素27参与了腰椎间盘突出症的病理过程

Interleukin-27 is associated with the pathogenesis of lumbar disc herniation

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