黄芪多糖干预对骨关节炎模型小鼠关节软骨损伤的修复

doi:10.12307/2022.627

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (20): 3236-3242.doi: 10.12307/2022.627

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

黄芪多糖干预对骨关节炎模型小鼠关节软骨损伤的修复

史桂荣1，任博文2，张仲博2，王莉莎2，张啟威2，史栋梁2

1商丘医学高等专科学校临床医学院中医教研室，河南省商丘市 476299；2河南省中医院骨病一科，河南省郑州市 450000

收稿日期:2021-04-30 接受日期:2021-07-10 出版日期:2022-07-18 发布日期:2022-01-19
通讯作者: 史栋梁，硕士，副主任医师，主要从事骨损伤方面的研究。
作者简介:史桂荣，女，1970年生，河南省商丘市人，汉族，2006年河南省中医院毕业，硕士，副教授，主要从事骨与关节相关疾病的研究。

Astragalus polysaccharides repair articular cartilage damage in a mouse osteoarthritis model

Shi Guirong1, Ren Bowen2, Zhang Zhongbo2, Wang Lisha2, Zhang Qiwei2, Shi Dongliang2

1Department of Traditional Chinese Medicine, Clinical College of Shangqiu Medical College, Shangqiu 476299, Henan Province, China; 2First Department of Orthopedics, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China

Received:2021-04-30 Accepted:2021-07-10 Online:2022-07-18 Published:2022-01-19
Contact: Shi Dongliang, Master, Associate chief physician, First Department of Orthopedics, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, Henan Province, China
About author:Shi Guirong, Master, Associate professor, Department of Traditional Chinese Medicine, Clinical College of Shangqiu Medical College, Shangqiu 476299, Henan Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
骨关节炎：又称为骨关节病、退行性关节病和骨质增生，是一种最常见的关节疾病。该病不仅发生关节软骨损害，还累及整个关节，包括软骨下骨、韧带、关节囊、滑膜和关节周围肌肉，最终发生关节软骨退变、纤维化、断裂、溃疡及整个关节面的损害。典型的临床表现包括疼痛、僵硬和关节变形。
泛素化：是指泛素蛋白在一系列特殊酶的作用下，将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并对靶蛋白进行特异性修饰的过程。蛋白质泛素化的结果是使得被标记的蛋白质被蛋白酶分解为较小的多肽、氨基酸以及可以重复使用的泛素。

背景：黄芪多糖对骨关节炎有确切疗效，但其作用机制还不清楚。
目的：探讨黄芪多糖调控包含WW域的E3泛素蛋白连接酶2(WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2)介导的Notch受体1泛素化对骨关节炎的影响。
方法：①体内实验：30只C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组、黄芪多糖组，每组10只。除假手术组外，构建小鼠骨关节炎模型，黄芪多糖组给予黄芪多糖干预，干预4周后麻醉小鼠取膝关节组织，番红O染色法、国际骨关节炎研究协会评分评估小鼠关节软骨损伤情况。②体外实验：采用5 μg/L白细胞介素1β培养C28/12细胞24 h建立骨关节炎细胞模型，分为对照组、白细胞介素1β组、50 mg/L 黄芪多糖处理组、黄芪多糖联合Notch受体1过表达或WWP2干扰组。MTT法检测细胞增殖，流式细胞术测凋亡，蛋白质免疫共沉淀实验用于验证WWP2和Notch受体1的结合，泛素化实验分析黄芪多糖对WWP2介导的Notch受体1泛素化水平的影响，酶联免疫吸附法检测小鼠膝关节组织和C28/12细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平，免疫印迹法检测小鼠膝关节组织和C28/12细胞中WWP2、Notch受体1、锯齿状Notch配体1和Notch胞内域1蛋白的表达。
结果与结论：①体内实验结果证实，黄芪多糖干预缓解了小鼠软骨损伤，抑制了膝关节组织基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平，增加了蛋白聚糖和Ⅱ型胶原表达水平；②体外实验结果证实，黄芪多糖干预促进了细胞增殖、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原及WWP2的表达，抑制了细胞凋亡、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平、Notch受体1、锯齿状Notch配体1和Notch胞内域1蛋白的表达，Notch受体1过表达和WWP2干扰逆转了黄芪多糖的作用；③黄芪多糖促进了WWP2介导的Notch受体1的泛素化水平；④结果表明，黄芪多糖通过提高WWP2介导的Notch受体1泛素化水平，抑制Notch信号通路，对小鼠骨关节炎起到一定的治疗作用。
缩略语：包含WW域的E3泛素蛋白连接酶2：WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2；国际骨关节炎研究协会：Osteoarthritis Research Society International，OARSI

https://orcid.org/0000-0003-1120-1417 (史桂荣)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 黄芪多糖, WWP2, 泛素化, Notch受体1, 骨关节炎

Abstract: BACKGROUND: Astragalus polysaccharide has a definite effect on osteoarthritis, but its mechanism of action is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of astragalus polysaccharide on osteoarthritis through regulating ubiquitination of Notch receptor 1 mediated by WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2 (WWP2).
METHODS: In the in vivo experiment, 30 C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups (n=10): a sham operation group, a model group, and an astragalus polysaccharide group. A mouse osteoarthritis model was established in the model and astragalus polysaccharide groups. Mice in the astragalus polysaccharide group were treated with astragalus polysaccharide. After 4 weeks of intervention, the knee joint tissue was taken under anesthesia. Safranin O staining method and Osteoarthritis Research Society International score were used to evaluate the damage of articular cartilage in mice. In the in vitro experiment, C28/12 cells were cultured with 5 μg/L interleukin 1β for 24 hours to establish osteoarthritis cell models, which were divided into a control group, an interleukin 1β group, a 50 mg/L astragalus polysaccharide group, and an astragalus polysaccharide-Notch receptor 1 overexpression and a WWP2 interference group. 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide assay was used to detect cell proliferation. Flow cytometry was used to detect apoptosis. Co-immunoprecipitation assay was used to verify the binding of WWP2 and Notch receptor 1. Ubiquitination experiment was used to analyze the effect of astragalus polysaccharides on the ubiquitination of Notch receptor 1 mediated by WWP2. Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect the levels of proteoglycans, type II collagen, matrix metallopeptidase 3, and matrix metallopeptidase 13 in mouse knee joint tissue and C28/12 cells. Western blot assay was used to detect the protein expression of WWP2, Notch receptor 1, jagged canonical Notch ligand 1, and Notch intracellular domain 1 in mouse knee joint tissue and C28/12 cells.
RESULTS AND CONCLUSION: The results of in vivo experiments confirmed that intervention of astragalus polysaccharides alleviated cartilage damage in mice, inhibited the levels of matrix metallopeptidase 3 and matrix metallopeptidase 13, and promoted the expression of proteoglycans and type II collagen in mouse knee joint tissue. The results of in vitro experiments confirmed that the intervention of astragalus polysaccharides promoted cell proliferation and the expression of proteoglycan, type II collagen, and WWP2, and inhibited cell apoptosis and the expression of matrix metallopeptidase 3 and matrix metallopeptidase 13, Notch receptor 1, jagged canonical Notch ligand 1, and Notch intracellular domain 1, while Notch receptor 1 overexpression and WWP2 interference reversed the effect of astragalus polysaccharides. Astragalus polysaccharides promoted the ubiquitination of Notch receptor 1 mediated by WWP2. To conclude, astragalus polysaccharides can play a certain therapeutic effect on mouse osteoarthritis by increasing the WWP2-mediated ubiquitination level of Notch receptor 1 and inhibiting the Notch signaling pathway.

Key words: astragalus polysaccharide, WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2, ubiquitination, Notch receptor 1, osteoarthritis

中图分类号:

史桂荣, 任博文, 张仲博, 王莉莎, 张啟威, 史栋梁. 黄芪多糖干预对骨关节炎模型小鼠关节软骨损伤的修复[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3236-3242.

Shi Guirong, Ren Bowen, Zhang Zhongbo, Wang Lisha, Zhang Qiwei, Shi Dongliang. Astragalus polysaccharides repair articular cartilage damage in a mouse osteoarthritis model[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(20): 3236-3242.

图/表（结果） 4

2.1 实验动物数量分析共30只C57BL/6小鼠进行实验，其中模型组有1只小鼠手术过程中死亡，系实验人员操作失误，余无特殊，针对这只小鼠已进行后续实验补充。
2.2 黄芪多糖对小鼠骨关节炎的影响与假手术组比较，模型组小鼠膝关节组织软骨颤动和软骨侵蚀明显增加(P < 0.05)，膝关节组织中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原水平和膝关节组织匀浆中WWP2蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，膝关节组织中基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶13水平和膝关节组织匀浆中Notch受体1蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)。与模型组比较，黄芪多糖组小鼠膝关节组织软骨颤动和软骨侵蚀明显减少(P < 0.05)，膝关节组织中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原水平和膝关节组织匀浆中WWP2蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)，膝关节组织中基质金属蛋白酶3和、基质金属蛋白酶13水平和膝关节组织匀浆中Notch受体1蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)。详见图1。

2.3 黄芪多糖对白细胞介素1β诱导的C28/12细胞功能的影响与对照组比较，白细胞介素1β组细胞增殖明显降低(P < 0.05)，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分泌水平明显降低(P < 0.05)，细胞凋亡明显升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13分泌水平明显升高(P < 0.05)。与白细胞介素1β组比较，白细胞介素1β+黄芪多糖组细胞增殖明显升高(P < 0.05)，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分泌水平明显升高(P < 0.05)，细胞凋亡明显降低(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13分泌水平明显降低(P < 0.05)。详见图2。

2.4 黄芪多糖调控Notch受体1通路和泛素化对C28/12细胞功能的影响与对照组比较，白细胞介素1β组细胞Notch受体1、JAG1和Notch胞内域1蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)，细胞增殖明显降低(P < 0.05)，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分泌水平明显降低(P < 0.05)，细胞凋亡明显增加(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13分泌水平明显升高(P < 0.05)。与白细胞介素1β组比较，白细胞介素1β+黄芪多糖+空载体组细胞Notch受体1、JAG1和Notch胞内域1蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，细胞增殖明显升高(P < 0.05)，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分泌水平明显升高(P < 0.05)，细胞凋亡明显降低(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13分泌水平明显降低(P < 0.05)。与白细胞介素1β+黄芪多糖+空载体组比较，白细胞介素1β+黄芪多糖+Notch受体1过表达组细胞Notch受体1、JAG1和Notch胞内域1蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)，细胞增殖明显降低(P < 0.05)，蛋白聚糖和Ⅱ型胶原分泌水平明显降低(P < 0.05)，细胞凋亡明显升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13分泌水平明显升高(P < 0.05)。详见图3。

此外，黄芪多糖明显促进了Notch受体1的泛素化水平。
2.5 黄芪多糖调控WWP2介导Notch受体1的泛素化蛋白质免疫共沉淀实验结果表明E3泛素连接酶WWP2与Notch受体1结合了。泛素化分析结果表明白细胞介素1β明显抑制了WWP2介导的Notch受体1泛素化水平，而黄芪多糖逆转了这种效果。免疫印迹实验结果表明，与白细胞介素1β+黄芪多糖+杂乱干扰组比较，白细胞介素1β+黄芪多糖+WWP2干扰组C28/12细胞WWP2蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)，而Notch受体1、JAG1和Notch胞内域1蛋白表达水平明显升高(P < 0.05)。详见图4。

参考文献

[1] LOESER R. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum. 2014;64:1697-1707.
[2] O’Neill TW, McCabe PS, McBeth J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Pract Res Clin Rheumatol. 2018;32(2):312-326.
[3] Kang D, Shin J, Cho Y, et al. Stress-activated miR-204 governs senescent phenotypes of chondrocytes to promote osteoarthritis development. Sci Transl Med. 2019;11(486):eaar6659.
[4] JIE S, ABU-AMER Y, O’KEEFE R, et al. Inflammation and epigenetic regulation in osteoarthritis. Connect Tissue Res. 2017;58(1):49-63.
[5] EDITH C, CÉLINE D, FEDERICA C, et al. Chondrocyte dedifferentiation and osteoarthritis (OA). Biochem Pharmacol. 2019;165:49-65.
[6] 肖剑伟, 周唯践, 蔡旭, 等. 黄芪多糖抑制氧化应激致大鼠软骨细胞损伤及凋亡的作用机制分析[J]. 临床和实验医学杂志, 2020, 19(10):1040-1044.
[7] LAN L, JIANG Y, ZHANG W, et al. Expression of Notch signaling pathway during osteoarthritis in the temporomandibular joint. J Craniomaxillofac Surg. 2017;45(8):1338-1348.
[8] LIN NY, DISTLER A, BEYER C, et al. Inhibition of Notch1 promotes hedgehog signalling in a HES1-dependent manner in chondrocytes and exacerbates experimental osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2016;75(11): 2037.
[9] CHENG HJ, HSU WT, CHEN CN, et al. Activation of NOTCH1 by Shear Force Elicits Immediate Cytokine Expression in Human Chondrocytes. Int J Mol Sci. 2020;21(14):4958.
[10] ZHENG L, CONNER SD. PI5P4Kγ functions in DTX1-mediated Notch signaling. Proc Natl Acad Sci U S A . 2018;115(9):E1983-E1990.
[11] ROTIN D, KUMAR S. Physiological functions of the HECT family of ubiquitin ligases. Nature Rev Mol Cell Biol. 2009;10(6):398-409.
[12] MOKUDA S, NAKAMICHI R, MATSUZAKI T, et al. Wwp2 maintains cartilage homeostasis through regulation of Adamts5. Nature Commun. 2019;10(1):2429.
[13] GENG Z, WEI L, ZHANG C, et al. Astragalus polysaccharide, a component of traditional Chinese medicine, inhibits muscle cell atrophy (cachexia) in an in vivo and in vitro rat model of chronic renal failure by activating the ubiquitin-proteasome pathway. Exp Ther Med. 2017;14(1):91-96.
[14] GLASSON SS, CHAMBERS MG, VAN DEN BERG WB, et al. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis Cartilage. 2010;18 Suppl 3:S17-23.
[15] MATSUZAKI T, MATSUSHITA T, TAKAYAMA K, et al. Disruption of Sirt1 in chondrocytes causes accelerated progression of osteoarthritis under mechanical stress and during ageing in mice. Ann Rheum Dis. 2014;73(7):1397-1404.
[16] SUN X, ZHEN X, HU X, et al. Osteoarthritis in the Middle-Aged and Elderly in China: Prevalence and Influencing Factors. Int J Environ Res Public Health. 2019;16(23):4701.
[17] O’BRIEN MS, MCDOUGALL JJ. Age and frailty as risk factors for the development of osteoarthritis. Mech Ageing Dev. 2019;180:21-28.
[18] AICHER WK, ROLAUFFS B. The spatial organisation of joint surface chondrocytes: review of its potential roles in tissue functioning, disease and early, preclinical diagnosis of osteoarthritis. Ann Rheum Dis. 2014; 73(4):645-653.
[19] LYNDIN M, GLUSCHENKO N, SIKORA V, et al. Morphofunctional features of articular cartilage structure. Folia medica Cracoviensia. 2019;59(3): 81-93.
[20] WAEL BA, MOUNA B, MERIEM M, et al. A cross sectional study of bone and cartilage biomarkers: correlation with structural damage in rheumatoid arthritis. Libyan J Med. 2018;13(1):1512330.
[21] LI H, WANG D, YUAN Y, et al. New insights on the MMP-13 regulatory network in the pathogenesis of early osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2017;19(1):248.
[22] TANG LP, DING JB, LIU ZH, et al. LncRNA TUG1 promotes osteoarthritis-induced degradation of chondrocyte extracellular matrix via miR-195/MMP-13 axis. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018; 22(24):8574-8581.
[23] HANG F, HUANG L, WELCH I, et al. Early Changes of Articular Cartilage and Subchondral Bone in The DMM Mouse Model of Osteoarthritis. Sci Rep. 2018;8(1):2855.
[24] LIAO J, LI C, HUANG J, et al. Structure Characterization of Honey-Processed Astragalus Polysaccharides and Its Anti-Inflammatory Activity In Vitro. Molecules. 2018;23(1):168.
[25] DONG N, LI X, XUE C, et al. Astragalus polysaccharides alleviates LPS‐induced inflammation via the NF‐κB/MAPK signaling pathway. J Cell Physiol. 2020;235(7-8):5525-5540.
[26] MENG Q, DU X, WANG H, et al. Astragalus polysaccharides inhibits cell growth and pro-inflammatory response in IL-1 beta-stimulated fibroblast-like synoviocytes by enhancement of autophagy via PI3K/AKT/mTOR inhibition. Apoptosis. 2017;22(9):1138-1146.
[27] FAN L, LI M, CAO FY, et al. Astragalus polysaccharide ameliorates lipopolysaccharide-induced cell injury in ATDC5 cells via miR-92a/KLF4 mediation. Biomed Pharmacother. 2019;118:109180.
[28] SIEBEL C, LENDAHL U. Notch Signaling in Development, Tissue Homeostasis, and Disease. Physiol Rev. 2017;97(4):1235-1294.
[29] HENRIQUE D, SCHWEISGUTH F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 2019;146(3): dev172148.
[30] GUAN YJ, LI J, YANG X, et al. Evidence that miR-146a attenuates aging- and trauma-induced osteoarthritis by inhibiting Notch1, IL-6, and IL-1 mediated catabolism. Aging Cell. 2018;17(3):e12752.
[31] LIU W, TANG X, QI X, et al. The Ubiquitin Conjugating Enzyme: An Important Ubiquitin Transfer Platform in Ubiquitin-Proteasome System. Int J Mol Sci. 2020;21(8):2894.
[32] COLLINS GA, GOLDBERG AL. The Logic of the 26S Proteasome. Cell. 2017;169(5):792.
[33] LU L, HUANG YF, CHEN DX, et al. Astragalus polysaccharides decrease muscle wasting through Akt/mTOR, ubiquitin proteasome and autophagy signalling in 5/6 nephrectomised rats. J Ethnopharmacol. 2016;186:125-135.
[34] WANG Y, YANG BP, CHI YG, et al. Effect of Deltex-1 on proliferation and differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells into smooth muscle cells. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018;22(12):3627.

引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物体内实验和细胞学体外实验，多组间样本均数比较采用方差分析，组间样本均数两两比较采用Student’s t检验。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年5月在河南省中医药大学SPF级实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 30只SPF级雄性C57BL/6小鼠，鼠龄10周龄左右，体质量25-28 g，购自河南省中医院，动物生产许可证号：SYXK(豫)2016-0009。
1.3.2 主要试剂与仪器黄芪多糖，货号：A860847，购自上海麦克林生化科技有限公司；蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13的酶联免疫吸附试剂盒购自美国Invitrogen公司；番红O染色液和快绿染色液购自上海铭博生物科技有限公司；兔单克隆Notch受体1、Jagged1(JAG1)抗体和Notch胞内域1购自英国Abcam公司；兔多克隆WWP2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶抗体和HRP标记的兔抗鼠酶标二抗购自美国Sigma公司；WWP2短发夹RNA表达载体、杂乱干扰和pRK5质粒购自美国Millipore公司；腺病毒空载体和腺病毒过表达Notch受体1载体pcDNA3.1- Notch受体1购自美国Bio-Rad公司；His、Flag、HA和Myc标签抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；DMEM培养基、胎牛膝关节组织和HEK293T细胞购自美国Gibco公司；MTT染色液购自北京BioTeke公司；ECL发光液购自美国Thermo公司；pRK5-Myc-WWP2、pRK5-Flag-Notch受体1和pRK5-HA-Ubiquitin质粒均由生工生物工程(上海)股份有限公司构建；凝胶成像分析仪购自广州瑞丰实验设备有限公司；酶标仪购自美国ELX800公司。
1.4 方法

1.4.1 动物模型制备及给药按照随机数字表法将30只C57BL/6小鼠分为3组，分别为假手术组、模型组、黄芪多糖组，每组10只。使用半月板损伤术建立骨关节炎小鼠模型，腹腔内注射35 mg/kg戊巴比妥钠麻醉小鼠，剃除右膝膝关节部位毛并消毒后，切开关节囊，用眼科手术剪刀剪断内侧半月板胫韧带，缝合并消毒，半月板损伤手术结束后，所有小鼠在笼内自由活动和饮食；假手术组小鼠仅切开关节囊。黄芪多糖组小鼠术后每3 d关节腔注射5 g/kg黄芪多糖，持续4周；模型组小鼠手术后每3 d关节腔注射等体积的生理盐水。给药结束后采用麻醉断颈法处死小鼠。所有涉及小鼠的实验均经河南省中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：HNUCM-2019065。

1.4.2 取材及切片制备 3组小鼠均在给药4周后用相同处理办法进行取材。具体操作步骤如下：采用腹腔内注射35 mg/kg戊巴比妥钠麻醉断颈法处死小鼠后，取右膝膝关节组织并剃除多余肌肉组织，将膝关节组织置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h，再置于浓度为10%的乙二胺四乙酸溶液中在摇床上脱钙20 d，脱钙液每2 d更换1次。脱钙完成后使用双蒸水冲洗，再将样本置于体积分数为70%，80%，90%，95%，100%的乙醇中脱水，每个梯度设置为8 h。脱水完成后，将样本浸入融化状态的石蜡液体中，30 min后进行包埋。对蜡块修整后使用切片机从样本内侧进行连续切片，每张切片厚5 μm，挑选每组中包含整个关节面的切片进行编号，将其置于37 ℃恒温培养箱内过夜干燥。
1.4.3 番红O染色法将切片脱蜡水化后用0.1%番红O染液和0.001%快绿染液染色。盲眼观察人员以每只小鼠膝关节组织25 μm间隔切片为参照使用国际骨关节炎研究协会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)评分标准对每个膝关节组织进行了12张切片评分[14]。OARSI评分标准：0分为正常；1分为潮线震颤，但没有软骨丧失；2分为垂直裂隙延伸到浅表层以下，且表层部分软骨丧失；3分为钙化软骨的垂直裂/侵蚀，延伸到关节面< 25%；4分为钙化软骨的垂直裂/侵蚀，延伸到关节面25%-50%；5分为钙化软骨的垂直裂/侵蚀，延伸到关节面51%-75%；6分为钙化软骨的垂直裂/侵蚀，延伸到关节面> 75%。
1.4.4 细胞培养及处理人正常软骨细胞系(C28/12)购自美国ATCC细胞库，将细胞以3×108 L-1的浓度接种于6孔细胞培养板中，培养于含10%胎牛膝关节组织和1%青霉素和链霉素的DMEM培养基和37 ℃ 体积分数5%CO2的条件下。对照组细胞加入等体积生理盐水；白细胞介素1β组细胞使用5 μg/L 白细胞介素1β培养24 h建立骨关节炎细胞模型；黄芪多糖处理组细胞在白细胞介素1β诱导后加入50 mg/L黄芪多糖孵育细胞72 h；白细胞介素1β+黄芪多糖+空载体组和白细胞介素1β+黄芪多糖+杂乱干扰组细胞分别在细胞培养液中加入5 μg/L 白细胞介素1β和空载体或杂乱干扰培养24 h后再加入50 mg/L黄芪多糖培养72 h；白细胞介素1β+黄芪多糖+Notch受体1过表达组和白细胞介素1β+黄芪多糖+WWP2干扰组细胞分别加入5 μg/L 白细胞介素1β和2 μg pcDNA-Notch受体1或40 nmol/L WWP2 短发夹RNA培养24 h后，加入50 mg/L黄芪多糖培养72 h。
1.4.5 MTT法检测C28/12细胞增殖在细胞培养的第0，24，48和72小时分别加入5 g/L MTT染液20 μL于37 ℃孵育4 h，吸出培养液并加入150 μL DMSO，待结晶全部溶解后，使用酶标仪检测吸光度(A)值，检测波长为 570 nm。
1.4.6 酶联免疫吸附法检测膝关节组织和细胞中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平小鼠给药结束后收集膝关节组织。细胞培养72 h后，使用相应酶联免疫吸附试剂盒按说明书操作，检测膝关节组织和细胞培养液上清中蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平。
1.4.7 免疫印迹法检测WWP2、Notch受体1、锯齿状Notch配体1和Notch胞内域1蛋白表达水平小鼠给药结束后麻醉断头处死，取膝关节组织使用液氮研磨法制作组织匀浆。使用RIPA裂解液裂解细胞并提取组织匀浆和细胞总蛋白，使用BCA试剂盒测定样品蛋白浓度。电泳结束后用蛋白转膜仪将蛋白转印至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶将膜封闭1 h，TBST洗膜完成后，用一抗WWP2(1∶2 500稀释)、Notch受体1(1∶1 000稀释)、JAG1(1∶1 000稀释)、Notch胞内域1(1∶500稀释)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(1∶2 500稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，加入HRP标记的兔抗鼠酶标二抗 (1∶1 000稀释) 室温孵育2 h，洗膜完成后在ECL中显色。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参甘油醛-3-磷酸脱氢酶条带灰度值。
1.4.8 蛋白质免疫共沉淀分析使用在线数据库UbiBrowser(http://ubibrowser.ncpsb.org/ubibrowser/home/index)预测Notch受体1和WWP2的结合。HEK293T细胞培养在含10%胎牛膝关节组织的DMEM培养基中，待细胞长至80%，分别加入质量浓度为1 g/L的质粒在饥饿条件下进行转染，24 h后吸取培养液，加入1 mL PBS并刮取细胞转移至1.5 mL EP管中，从中吸取100 μL 作为input。将剩余的细胞悬液在6 000 r/min，室温下离心2 min，去上清，加入1 mL细胞裂解缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100，0.5 mmol/L 乙二胺四乙酸，0.5 mmol/L DTT)充分混匀，在4 ℃ 3 000 r/min离心1 min去上清，加入预冷PBS重悬，重复3次后加入等体积PBS充分混匀，取适量预混液加入抗体进行反应，然后用免疫印迹法分析。
1.4.9 泛素化分析 HEK293T细胞转染后，在变性缓冲液中收集细胞(6 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L Na2HPO4/NaH2PO4，pH 8.0，10 mmol/L咪唑)。裂解液与Ni-NTA琼脂糖珠孵育3 h，然后用变性缓冲液洗涤4次，用低盐缓冲液洗涤2次(25 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，20 mmol/L咪唑)。加入50 μL含有200 mmol/L咪唑的2×SDS蛋白上样缓冲液至泛素化蛋白复合物中，95 ℃金属浴15 min。离心后，用免疫印迹法分析上清。
1.4.10 流式细胞术检测C28/12细胞凋亡以3×108 L-1的浓度接种于培养基孵育24 h后，收集细胞并用预冷PBS洗涤3次。将细胞重悬在含有PI的缓冲液中，室温培养15 min后，使用BD LSRFortessa细胞分析仪进行流式细胞术检测细胞凋亡。
1.5 主要观察指标 ①骨关节炎OARSI评分；②小鼠膝关节组织蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13表达水平；③小鼠膝关节组织包含WWP2和Notch受体1蛋白表达水平；④C28/12细胞增殖、凋亡、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原、基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平和包含WWP2和Notch受体1蛋白表达水平。
1.6 统计学分析此次研究所有数据均使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，以x±s表示。采用EXCELL 2016整理汇总资料，GraphPad Prism软件做图分析，画图软件和Photoshop软件处理图片。多组间样本均数比较采用方差分析，组间样本均数两两比较采用Student’s t检验，以P < 0.05记为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎是一种常见于老年人中的关节软骨退行性疾病，有多种因素导致骨关节炎的进展，包括遗传因素、机械压力和老化[15-17]。关节软骨是一种无血管、无神经、淋巴管和黏弹性的结缔组织，能够自主承担载荷，并为关节提供几乎无摩擦的运动[18-19]，软骨损伤为患者的生活带来了极大不便。关节软骨主要由水和细胞外基质组成，包括蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白[20]。软骨细胞是关节腔内负责细胞外基质合成和转化的主要细胞，骨关节炎中，炎性细胞因子的产生使软骨细胞内基质金属蛋白酶系统被激活，导致细胞外基质降解，从而使细胞暴露于各种因素和成分中，最终影响软骨细胞的表型和行为[21-22]。因而，此次研究使用白细胞介素1β诱导C28/12细胞建立骨关节炎细胞模型。关节半月板损伤术是常见的骨关节炎模型[23]，在此次研究中，采用半月板损伤的方法建立骨关节炎小鼠模型。
近年来，对于黄芪多糖的研究变得越来越热门，黄芪多糖是中药黄芪的主要活性成分，具有显著的抗炎功效[24-26]。有研究发现，黄芪多糖可以显著降低小鼠软骨细胞内的活性氧水平，抑制细胞凋亡，缓解软骨细胞损伤[27]，但其作用机制还不清楚。此次研究采用黄芪多糖干预骨关节炎小鼠和白细胞介素1β诱导后的C28/12细胞，结果发现黄芪多糖可提高小鼠膝关节组织和C28/12细胞中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白水平，降低基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平。Notch信号通路在调控细胞功能的过程中起着重要作用，在哺乳动物体中，当Notch结合到细胞表面的配体(如JAG1)时信号被激活，Notch在细胞外区域发生构象变化，释放Notch细胞内结构域，Notch细胞内结构域随后易位到细胞核调控基因的表达[28-29]。有研究发现，在骨关节炎中Notch通路的激活促进了炎症环境的进展[30]。此次研究首次发现黄芪多糖可降低骨关节炎小鼠膝关节组织中Notch受体1蛋白的表达，还进一步研究了黄芪多糖能否激活Notch信号通路，上调JAG1和Notch胞内域1蛋白的表达，缓解白细胞介素1β诱导C28/12细胞的细胞外基质降解。在实验分组中，增设了白细胞介素1β+黄芪多糖+Notch受体1过表达组，结果发现黄芪多糖可提高白细胞介素1β诱导的C28/12细胞中JAG1和Notch胞内域1蛋白的表达水平，以及膝关节组织蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白水平，降低基质金属蛋白酶3和基质金属蛋白酶13水平，而Notch受体1过表达可逆转黄芪多糖的作用。
泛素-蛋白酶体途径是一种普遍的蛋白质周转系统，可以调节众多细胞过程。在泛素化修饰的过程中，泛素蛋白通过E1、E2和E3泛素蛋白连接酶的协同作用与底物结合，随后泛素标记的底物复合物被 26S 蛋白酶体降解[31-32]。有研究发现，黄芪多糖可通过降低E3泛素连接酶MAFbx和MuRF1的表达水平，改善5/6肾切除大鼠的蛋白质代谢和肌肉萎缩[33]。据报道，骨关节炎患者和骨关节炎小鼠软骨中WWP2和Wwp2的水平均降低，且白细胞介素1β诱导人和小鼠软骨细胞后，WWP2和Wwp2的水平均受到抑制，而将体外转录的Wwp2 mRNA注射到小鼠关节腔中可缓解实验性骨关节炎[12]。此次研究发现，骨关节炎小鼠膝关节组织和白细胞介素1β诱导的C28/12细胞中WWP2的表达水平均降低，且黄芪多糖干预可提高WWP2的表达水平。据报道，E3泛素连接酶DTX1可以通过阻止Notch受体1传递到细胞表面抑制Notch信号通路[10，34]。此次研究发现黄芪多糖可促进Notch受体1的泛素化水平，此外，使用在线数据库UbiBrowser预测发现WWP2是与Notch受体1相互作用的E3泛素蛋白连接酶之一，并且蛋白质免疫共沉淀实验证实了二者的相互作用。泛素化分析结果表明，白细胞介素1β的添加抑制了WWP2介导的Notch受体1的泛素化水平，而黄芪多糖可逆转白细胞介素1β的作用。为了进一步研究黄芪多糖通过调控WWP2对Notch信号通路的影响。在实验分组中，增设了白细胞介素1β+黄芪多糖+WWP2干扰组，结果发现WWP2干扰促进了C28/12细胞中Notch受体1、JAG1和Notch胞内域1蛋白的表达水平，激活了Notch信号通路。
当然，此次研究仍存在诸多不足之处：①未研究黄芪多糖的不同浓度对动物模型和细胞模型中骨关节炎的影响；②体内实验中没有对软骨形态和软骨厚度等指标进行记录分析；③对黄芪多糖治疗骨关节炎机制的研究不够深入。通过这一实验，虽然对黄芪多糖治疗骨关节炎的效果和机制有了一定的认识，但其在骨关节炎中的具体作用以及其调控的蛋白网络仍有待更进一步的研究。
综上所述，动物模型以及体外C28/12细胞实验结果显示，根据番红O染色、酶联免疫吸附实验、免疫印迹实验和泛素化实验结果来看，黄芪多糖可通过提高骨关节炎中WWP2蛋白的表达，促进Notch受体1的泛素化水平，抑制Notch通路的激活，发挥治疗骨关节炎的作用。此次研究为黄芪多糖治疗骨关节炎的临床试验开展提供了新的思路和方法，并且为骨关节炎的治疗提供了新的靶点。
结论：①模型组小鼠骨关节炎严重程度比黄芪多糖组更重；②黄芪多糖可提高骨关节炎小鼠膝关节组织和白细胞介素1β诱导的C28/12细胞中蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白表达水平，降低基质金属蛋白酶的表达水平；③黄芪多糖可促进骨关节炎小鼠膝关节组织和白细胞介素1β诱导的C28/12细胞中WWP2的表达水平，抑制Notch受体1的表达水平；④黄芪多糖可提高WWP2介导的Notch受体1泛素化水平，抑制Notch信号通路的激活，从而缓解骨关节炎的进展。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

黄芪多糖干预对骨关节炎模型小鼠关节软骨损伤的修复

Astragalus polysaccharides repair articular cartilage damage in a mouse osteoarthritis model

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 4

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	张吉超, 董跃福, 牟志芳, 张震, 李冰言, 徐祥钧, 李佳意, 任梦, 董万鹏. 骨关节炎患者在不同步态角度下膝关节内部生物力学变化的有限元分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1357-1361.
[2]	金涛, 刘林, 朱晓燕, 史宇悰, 牛建雄, 张同同, 吴树金, 杨青山. 骨关节炎与线粒体异常[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1452-1458.
[3]	刘冬铖, 赵继军, 周子红, 吴沼锋, 俞颖豪, 陈宇浩, 冯德宏. 开放楔形胫骨高位截骨手术不同力线矫正参考方法的比较[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(6): 827-831.
[4]	何俊君, 黄泽灵, 洪振强. 阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 694-699.
[5]	林旭晨, 祝海年, 王增顺, 祁腾民, 刘立民, 索南昂秀. 黄腐酚对骨关节炎模型小鼠炎性因子及关节软骨的作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 676-681.
[6]	许磊, 韩晓强, 张锦涛, 孙海飚. 关节软骨细胞周围透明质酸产生、转化和功能特征[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 768-773.
[7]	张通, 蔡金池, 袁志发, 赵海燕, 韩兴文, 王文己. 基于透明质酸的复合水凝胶修复骨关节炎软骨损伤：应用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(4): 617-625.
[8]	刘少华, 周观明, 陈希聪, 肖可明, 蔡剑, 刘效仿. 单髁置换与胫骨高位截骨后运动学参数的变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 390-396.
[9]	杨德猛, 王长庚, 胡芯源, 敖沸. 杜仲醇提取物对骨关节炎模型大鼠关节软骨的保护[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3756-3761.
[10]	张婉霞, 尼加提·努尔穆罕默德, 买斯吐热木·黒力力, 柳江龙, 刘迪, 买买提吐逊·吐尔地. 关节腔内注射医用臭氧治疗颞下颌关节骨关节炎模型大鼠的合适剂量[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3700-3705.
[11]	苏剑清, 孙波, 丁韵蓉, 刘光明, 季伟, 蒋恩宇, 杨佳裕. 基于“损伤-修复-再损伤”方法制备兔膝骨关节炎滑膜炎模型[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3738-3743.
[12]	乔凌晖, 袁涛, 韩杰, 王冠承, 顾羊林. 原发性膝骨关节炎患者滑膜组织中与炎症相关circRNA的筛选和生物学功能分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3683-3690.
[13]	杨威, 袁普卫, 杜龙龙, 李雪枫, 高启萌, 韩清民. 骨关节炎患者外周血淋巴细胞基因表达谱的生物信息学分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3706-3713.
[14]	王为, 汤翔宇, 易智谦, 刘朝旭. 骨关节炎诱导软骨细胞凋亡和细胞外基质降解的机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3133-3140.
[15]	张学普, 吴月欣, 赵浩森, 班兆亮, 马晓虎, 佟刚, 杨立民. 环状RNA circ_0040646靶向抑制miR-188-3p调控膝骨关节炎软骨细胞的增殖、分化和凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(20): 3141-3146.