脐带间充质干细胞对衰老胸腺上皮细胞的作用及影响

doi:10.12307/2022.570

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (24): 3880-3885.doi: 10.12307/2022.570

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脐带间充质干细胞对衰老胸腺上皮细胞的作用及影响

杨再玲1，2，田川2，吕冠柯1，潘杭1，2，朱向情2，王金祥2，王凯2，阮光萍2，何志旭3，舒丽萍1，潘兴华2

1贵州医科大学，组织工程与干细胞实验中心，贵州省贵阳市 550004；2中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、昆明市干细胞与再生医学重点实验室、基础医学实验室，云南省昆明市 650032；3遵义医科大学附属医院儿科学教研室，贵州省遵义市 563100

收稿日期:2021-08-26 接受日期:2021-10-15 出版日期:2022-08-28 发布日期:2022-01-24
通讯作者: 潘兴华，博士，主任医师，中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院干细胞与免疫细胞生物医药技术国家地方联合工程实验室、云南省细胞治疗技术转化医学重点实验室、昆明市干细胞与再生医学重点实验室、基础医学实验室，云南省昆明市 650032
作者简介:杨再玲，女，1989年生，贵州省贵阳市人，仡佬族，贵州医科大学在读硕士，主要从事骨髓间充质干细胞抗衰老研究。
基金资助:
云南省科技计划项目重大科技专项(2018ZF007)，项目负责人：潘兴华

Effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on aging thymus epithelial cells

Yang Zailing1, 2, Tian Chuan2, Lyu Guanke1, Pan Hang1, 2, Zhu Xiangqing2, Wang Jinxiang2, Wang Kai2, Ruan Guangping2, He Zhixu3, Shu Liping1, Pan Xinghua2

1Tissue Engineering and Stem Cell Experimental Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; 2Stem Cells and Immune Cells Biomedical Techniques Integrated Engineering Laboratory of State and Regions, Cell Therapy Technology Transfer Medical Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming 650032, Yunnan Province, China; 3Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi 563100, Guizhou Province, China

Received:2021-08-26 Accepted:2021-10-15 Online:2022-08-28 Published:2022-01-24
Contact: Pan Xinghua, MD, Chief physician, Stem Cells and Immune Cells Biomedical Techniques Integrated Engineering Laboratory of State and Regions, Cell Therapy Technology Transfer Medical Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Basic Medical Laboratory, 920 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China
About author:Yang Zailing, Master candidate, Tissue Engineering and Stem Cell Experimental Center, Guizhou Medical University, Guiyang 550004, Guizhou Province, China; Stem Cells and Immune Cells Biomedical Techniques Integrated Engineering Laboratory of State and Regions, Cell Therapy Technology Transfer Medical Key Laboratory of Yunnan Province, Kunming Key Laboratory of Stem Cell and Regenerative Medicine, Basic Medical Laboratory, 920 Hospital of Joint Logistics Support Force of Chinese PLA, Kunming 650032, Yunnan Province, China
Supported by:
the Major Science and Technology Project of Yunnan Science and Technology Plan Project, No. 2018ZF007 (to PXH)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
胸腺上皮细胞：是胸腺微环境的最主要成分。根据表型和定位，胸腺上皮细胞可分为皮质胸腺上皮细胞和髓质胸腺上皮细胞。
Ki67：是人类第10号染色体上MKI-67基因所编码的一种蛋白，与细胞增殖密切相关并且可能是细胞增殖所必需的核蛋白。

背景：据文献报道，胸腺上皮细胞数量减少、功能紊乱是胸腺退化的重要因素之一，可导致胸腺发育、增殖缺陷以及外周T细胞功能障碍。课题组前期研究发现间充质干细胞在体内可以逆转衰老胸腺的结构和功能，具体作用机制尚不清楚。
目的：探讨脐带间充质干细胞在体外对衰老胸腺上皮细胞的作用及影响。
方法：将 200 μmol/L 过氧化氢分别作用于第4代胸腺上皮细胞24，48，72，96 h，通过CCK8法检测细胞活力，筛选200 μmol/L 过氧化氢作用72 h为制备衰老模型合适时间。取第4代脐带间充质干细胞，与衰老的胸腺上皮细胞共培养48 h后进行β-半乳糖苷酶染色检测衰老细胞变化；免疫荧光ki-67染色检测细胞增殖活性；流式细胞仪分析细胞周期变化；免疫组织化学染色法检测p53、p21蛋白阳性表达量；RT-PCR 检测衰老相关基因p21、p53以及pRb的mRNA表达水平。
结果与结论：与模型组相比，脐带间充质干细胞共培养组衰老胸腺上皮细胞β-半乳糖苷酶表达降低，细胞增殖能力升高，G2期细胞减少而S期细胞增多，免疫荧光p53、p21表达降低，p53、p21 mRNA 表达水平降低而pRb mRNA表达水平升高。共培养组β-半乳糖苷酶表达、细胞增殖能力、p53、p21、pRb表达等结果向着对照组趋势靠近。结果表明，脐带间充质干细胞能调控胸腺上皮细胞的衰老相关指标表达，促进胸腺上皮细胞的增殖与分裂，以逆转胸腺上皮细胞的衰老。

https://orcid.org/0000-0002-7642-5270 (杨再玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 脐带间充质干细胞, 胸腺, 胸腺上皮细胞, 共培养, 抗衰老, 免疫

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have found that the reduced number and dysfunction of thymus epithelial cells are one of the important factors of thymus degeneration. It can lead to thymic cell development, defective proliferation and peripheral T cell dysfunction. The previous research of our team found that mesenchymal stem cells can reverse the structure and function of aging thymus in vivo. The specific mechanism of action is still unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on aging thymus epithelial cells in vitro.
METHODS: The cell viability of the fourth generation thymus epithelial cells was determined by CCK8 assay after treatment with 200 μmol/L H2O2 for 24, 48, 72, and 96 hours, respectively. The 72 hours of 200 μmol/L H2O2 was selected as appropriate time for establishing senescence models. The fourth generation of umbilical cord mesenchymal stem cells was co-cultured with senescent thymic epithelial cells for 48 hours. The changes of senescent cells were detected by β-galactosidase staining. Cell proliferation was detected by immunofluorescence ki-67 staining. Cell cycle changes were analyzed by flow cytometry. Immunohistochemical staining was used to detect the positive expression levels of p53 and p21 proteins. The mRNA expression levels of senescence related genes p21, p53, and pRb were detected by RT-PCR.
RESULTS and CONCLUSION: Compared with the model group, the expression of β-galactosidase in coculture group was decreased; cell proliferation ability was increased; cells in G2 phase were decreased and cells in S phase were increased; immunofluorescence expression of p53 and p21 was increased; mRNA expression of p53 and p21 was decreased and pRb mRNA expression was increased. The results of β-galactosidase expression, cell proliferation ability, p53, p21, and pRb expression in the coculture group were compared with the control group, and the reverse degree was close to the control group. It is concluded that umbilical cord mesenchymal stem cells can regulate the senescence of thymic epithelial cells, promote the proliferation and division of thymic epithelial cells, and reverse the senescence of thymic epithelial cells.

Key words: stem cells, umbilical cord mesenchymal stem cells, thymus, thymus epithelial cells, co-culture, anti-aging, immunity

中图分类号:

杨再玲, 田川, 吕冠柯, 潘杭, 朱向情, 王金祥, 王凯, 阮光萍, 何志旭, 舒丽萍, 潘兴华. 脐带间充质干细胞对衰老胸腺上皮细胞的作用及影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(24): 3880-3885.

Yang Zailing, Tian Chuan, Lyu Guanke, Pan Hang, Zhu Xiangqing, Wang Jinxiang, Wang Kai, Ruan Guangping, He Zhixu, Shu Liping, Pan Xinghua. Effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on aging thymus epithelial cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(24): 3880-3885.

图/表（结果） 8

2.1 脐带间充质干细胞形态脐带间充质干细胞呈漩涡状、网状、辐射状生长，细胞表面标记物CD29，CD44，CD90，CD34，CD45的阳性表达率分别为100%，100%，99.9%，0.1%，0.9%，具备向成骨、成软骨、成脂肪等方向分化潜能[14]。第4代脐带间充质干细胞融合达培养瓶底部80%-90%以上时，细胞形态为长梭形，见图1。

2.2 筛选合适过氧化氢作用胸腺上皮细胞时间将对照组和200 μmol/L 过氧化氢分别作用24，48，72，96 h的胸腺上皮细胞进行CCK8活力检测，与对照组相比，随着过氧化氢作用时间的延长，细胞活力逐渐下降，到72 h时细胞活力降到最低，与96 h无明显差别，见图2。选择200 μmol/L 过氧化氢作用胸腺上皮细胞72 h进行后续实验。

2.3 脐带间充质干细胞对衰老胸腺上皮细胞的作用
2.3.1 各组胸腺上皮细胞衰老情况利用β-半乳糖苷酶染色来观察3组胸腺上皮细胞衰老程度，其中衰老细胞被染成蓝色。模型组大部分细胞被染成蓝色，共培养后蓝色细胞数量明显减少。利用Graphpad prism 9.0 统计软件进行分析，模型组蓝色细胞所占百分率(45%)高于对照组(10%)，差异有显著性意义(P < 0.000 1)；共培养组染成蓝色细胞率(15%)低于模型组，差异有显著性意义(P < 0.001)：共培养组与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，逆转程度向着对照组变化的趋势靠近，见图3。

2.3.2 免疫细胞荧光化学法检测胸腺上皮细胞Ki67阳性表达利用免疫细胞荧光化学法检测3组胸腺上皮细胞增殖情况，其中具有增殖活性细胞发出红色荧光，细胞核被染为蓝色。对照组大部分细胞高表达Ki67，而模型组少量细胞表达Ki67，细胞增殖活力呈下降趋势；共培养组的红色荧光细胞增加，说明细胞高表达Ki67，其增殖活力上升。利用Graphpad prism 9.0 统计软件进行分析，模型组细胞增殖活力为18%，明显低于对照组细胞增殖活力94%(P < 0.000 1)；共培养组细胞增殖活力为80%，明显高于模型组(P < 0.000 1)；共培养组与对照组比较差异有显著性意义(P < 0.01)，逆转程度向着对照组趋势靠近，见图4。

2.3.3 流式细胞仪检测各组胸腺上皮细胞的细胞周期利用流式细胞仪检测3组胸腺上皮细胞周期变化，与对照组相比，模型组G2期细胞百分比增多；与模型组相比，共培养组S期细胞百分比明显增加，利用Graphpad prism 9.0 统计软件进行分析，对照组细胞周期G2期细胞百分比(17.2%)明显低于模型组(26.9%)(P < 0.000 1)，经过共培养后，细胞周期进入S期，S期细胞比例(35.4%)明显高于模型组(15.4%)(P < 0.001)，见图5。

2.3.4 各组胸腺上皮细胞衰老相关基因 p53、p21 和 pRb 的 mRNA 表达水平利用Graphpad prism 9.0 统计软件进行分析，与对照组相比，模型组衰老相关基因p53、p21 mRNA表达水平升高(P < 0.000 1)，pRb mRNA表达水平降低(P < 0.000 1 )；与模型组相比，共培养组p53、p21 mRNA表达水平降低(P < 0.001)，PRb mRNA表达水平升高(P < 0.001)：共培养组p53、p21向对照组趋势靠近，pRb变化高于对照组，见图6。

2.3.5 免疫细胞荧光化学法检测胸腺上皮细胞p53、p21阳性表达利用免疫细胞荧光化学法检测3组胸腺上皮细胞p53、p21表达，其中高表达p53、p21细胞发出红色荧光，细胞核被染为蓝色。与对照组相比，模型组红色荧光数量及强度相对较高，共培养组的红色荧光细胞减少，强度减弱。利用Graphpad prism9.0 统计软件进行分析，模型组p53、p21表达阳性细胞分别为86%，80%，明显高于对照组p53(P < 0.001)和p21的阳性细胞量(P < 0.000 1)，共培养组p53、p21表达阳性细胞分别24%，20%，明显低于模型组(P < 0.000 1)；共培养组p53、p21向对照组趋势靠近，见图7，8。

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引言

胸腺是人体衰老最敏感的器官之一，是T淋巴细胞发育、分化和成熟的主要场所[1]，因此，胸腺对于建立和维持免疫系统的功能至关重要，这一基本能力主要由胸腺上皮细胞和组织驻留的造血细胞指导，它们是胸腺微环境的重要组成部分[2]。胸腺在出生前已发育完全，出生1年后，胸腺上皮细胞数量开始减少，这一过程被称为胸腺退化[3]，这可导致胸腺细胞发育、增殖缺陷以及外周 T 细胞功能障碍[4]。国内张毓[5]和谭建新等[6]对胸腺的起源、生长发育与衰老过程及机制进行了深入研究，发现胸腺上皮细胞在胸腺衰老过程中起关键作用，胸腺皮质和髓质交界处的上皮细胞凋亡增加可进一步导致皮质上皮细胞数量减少。
脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC)是一种来源于新生儿脐带组织的成体干细胞，其生物学特性与骨髓、脂肪和牙髓等来源间充质干细胞相似[7]，具有较强增殖能力和多向分化潜能[8]，可分化为内皮细胞、肌肉细胞、神经细胞和胸腺基质[9]。关于脐带间充质干细胞延缓或逆转胸腺衰老的研究报道较少，Jung等[10]发现脂肪间充质干细胞对大鼠胸腺衰老模型具有再生作用，表现为使大鼠胸腺体积和质量增加、促进小鼠胸腺上皮细胞系的增殖；王志红等[11]研究发现脐带间充质干细胞可迁移至胸腺且至少存活 1 周以上，并逆转衰老大鼠的胸腺结构和免疫功能，增加骨密度；王严影等[12]用骨髓间充质干细胞移植治疗衰老猕猴，发现衰老猕猴胸腺指数提高、T细胞输出水平增加、胸腺实质面积增大。由此可见，间充质干细胞对胸腺的结构和功能有改善作用，但是具体作用机制并不清楚。
该研究在体外用过氧化氢诱导胸腺上皮细胞衰老，借助Transwell共培养小室将脐带间充质干细胞与衰老的胸腺上皮细胞共培养，以探讨脐带间充质干细胞对衰老胸腺上皮细胞的作用，为脐带间充质干细胞逆转胸腺衰老提供技术参考方案与理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞体外实验，组内前后比较采用配对样本t检验。
1.2 时间及地点实验于2020年9-12月在中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院细胞生物治疗中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验细胞第4代人脐带间充质干细胞由中国人民解放军联勤保障部队第九二〇医院细胞生物治疗中心提供，胸腺上皮细胞购买于杭州美森细胞生物科技有限公司。
1.3.2 实验主要试剂胎牛血清、DMEM/F12 培养基、0.25% 胰蛋白酶 (BI 公司)；医用过氧化氢(广州南国药业)；细胞周期检测试剂盒(KGA，江苏凯基生物 )；β-半乳糖苷酶染色试剂盒(Solarbio公司)；自发荧光淬灭剂 (Servicebio公司，G1221)；牛血清白蛋白(Servicebio公司，G5001)；总 RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和定量PCR试剂盒(擎科生物)。
1.3.3 实验仪器 SW-CL-2F 型百万层级层流超净工作台(苏州佳宝净化工程设备公司)；离心机(湖南湘仪公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；FACScabilur流式细胞仪(美国BD公司)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS公司)；正置荧光显微镜(日本尼康)；Transwell培养小室(Corning 3412)；6孔培养板(Coring 3516)。
1.4 实验方法
1.4.1 脐带间充质干细胞的分离、培养脐带间充质干细胞的分离、纯化、培养、免疫表型鉴定及多向分化能力鉴定，可参考课题组既往发表的文献[13]。
1.4.2 CCK8法筛选过氧化氢作用胸腺上皮细胞的合适时间取第4代胸腺上皮细胞，在96孔板中配置100 μL浓度为2×107 L-1胸腺上皮细胞悬液，将培养板在37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱预培养24 h，每孔加入200 μmol/L 过氧化氢1 μL 作用24，48，72，96 h，向每孔加入CCK8溶液 10 μL ，在培养箱内孵育2 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值。对照组用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12正常培养，筛选过氧化氢作用胸腺上皮细胞时间72 h为合适时间。
1.4.3 实验分组
(1)对照组：取第4代胸腺上皮细胞，调整细胞浓度为2×108 L-1，吸取100 μL细胞悬液接种于6孔培养板中，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12正常培养。
(2)模型组：取第4代胸腺上皮细胞，调整细胞浓度为2×108 L-1，吸取100 μL细胞悬液接种于6孔培养板中，待细胞融合率在80%左右时，用 200 μmol/L 过氧化氢作用72 h后，改为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养48 h。
(3)共培养组：取第4代脐带间充质干细胞，调整细胞浓度为5×108 L-1，吸取100 μL细胞悬液接种于Transwell上室中，将Transwell 上室嵌套在模型组的6孔板中，用体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12共培养48 h。
1.4.4 β-半乳糖糖苷酶染色收集对照组、模型组、共培养组的胸腺上皮细胞，吸除细胞培养液， PBS洗涤1次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，吸除细胞固定液，PBS洗涤细胞3次，每次3 min，吸除PBS，每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃孵育过夜，用封口膜封住6孔板边缘防止蒸发，普通光学显微镜下观察，计数3个视野下蓝色阳性细胞数目。
1.4.5 免疫细胞荧光检测ki-67、p53、p21的表达收集对照组、模型组、共培养组的胸腺上皮细胞，多聚甲醛固定后，吸除固定液，加100 μL破膜工作液，室温孵育20 min，加入3%牛血清白蛋白均匀覆盖细胞，室温封闭30 min，然后分别加入ki-67、p53、p21抗体，平放于湿盒内4 ℃孵育过夜，加入CY3山羊抗兔室温孵育50 min，DAPI复染细胞核15 min，最后用抗荧光淬灭封固剂封固。镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像(DAPI紫外激发波长330-380 nm，发射波长420 nm，发蓝光；CY3激发波长510-560 nm，发射波长590 nm，发红光)。
1.4.6 流式细胞仪分析胸腺上皮细胞周期收集对照组、模型组、共培养组的胸腺上皮细胞，PBS洗涤细胞1次(2 000 r/min离心5 min)，调整细胞浓度为1×109 L-1，取1 mL单细胞悬液，离心去上清，加入体积分数为70%冷乙醇500 μL固定过夜，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液(1 000 r/min离心3 min)；加入提前配制好的 500 μL PI/RNase A 染色工作液，室温避光孵育30-60 min；记录激发波长488 nm处红色荧光。
1.4.7 QPCR检测衰老相关基因p53、p21、pRb的mRNA表达收集对照组、模型组、共培养组的胸腺上皮细胞，调整细胞浓度为5×109 L-1，取1 mL细胞悬液，用总RNA提取试剂盒按操作说明提取RNA，用反转录试剂盒按操作说明进行反转录，再用定量PCR试剂盒进行定量PCR检测 p53、p21、pRb的相对表达量。引物序列见表1。

1.5 主要观察指标 β-半乳糖苷酶染色阳性率；免疫荧光Ki67、p53、p21阳性表达；细胞周期百分比；p53、p21、pRb的mRNA表达。
1.6 统计学分析所有数据通过Graphpad prism 9.0统计软件进行分析，统计结果以x±s表示，组内前后比较采用配对样本t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

感染、衰老、怀孕、压力和其他过程都可以影响胸腺上皮细胞的生长和发育，导致胸腺萎缩或退化，促进胸腺再生的关键是细胞再生和三维空间结构重建[15]。脐带间充质干细胞具有促进组织细胞修复、抗炎、抗氧化应激等生物学功能，就可能成为延缓甚至逆转胸腺衰老的新方法。
过氧化氢作为小分子氧化剂易于通过氧化应激引起细胞衰老，是一种快速、便捷、可靠的衰老细胞模型[16]。该研究应用过氧化氢诱导正常的胸腺上皮细胞衰老，衰老细胞表现出生长缓慢，β-半乳糖苷酶染色阳性、细胞增殖能力减弱、细胞周期阻滞及相关衰老基因p21、p53 表达增加及pRb表达降低，成功构建了胸腺上皮细胞衰老模型，这为下一步的机制研究奠定了实验基础。
β-半乳糖苷酶染色、细胞分裂增殖能力停滞是细胞衰老最常用的标志物[17]。衰老细胞的细胞核可被β-半乳糖苷酶染成蓝色，这是细胞衰老检测的金标准[18]。该研究中，模型组β-半乳糖苷酶染色阳性率上升及细胞增殖力下降，与脐带间充质干细胞共培养后β-半乳糖苷酶染色阳性率下降及细胞增殖力升高。类似的研究结果国内外也有报道，在化疗损伤胸腺模型中发现，输注间充质干细胞后受损胸腺体积增大、胸腺细胞和胸腺上皮细胞数量增多、胸腺细胞和胸腺上皮细胞形态恢复[19]，证实间充质干细胞可以迁移到受损的胸腺并分泌细胞因子，如角质细胞生长因子可能调节胸腺微环境，与主要由上皮细胞表达的FGFR2Ⅲb结合，发挥修复上皮细胞损伤的保护作用[20]。CHOI等[21]发现扁桃体源性间充质干细胞与骨髓源性细胞联合移植加速了小鼠退化胸腺的恢复，可能通过诱导扁桃体源性间充质干细胞中FMS样酪氨酸激酶3配体(FLT3L)和成纤维细胞生长因子7(FGF7)的产生进而促进胸腺再生。研究表明，胸腺上皮细胞发育的必要细胞外因子包括来自间充质细胞的成纤维细胞生长因子7和成纤维细胞生长因子10[22]。这些结果表明了脐带间充质干细胞能逆转胸腺上皮细胞衰老、促进衰老胸腺上皮细胞增殖，其机制可能是脐带间充质干细胞分泌细胞生长因子促进损伤组织中的原位细胞生长和抗氧化应激、抑制细胞凋亡、促进自噬，提升组织细胞的生存能力[23]。
典型的细胞衰老特征是细胞周期停滞、自我更新和修复能力下降、生长受限[24]。细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B1、细胞周期蛋白D1是细胞周期的经典标志物，其中细胞周期蛋白A2在G1期向S期过渡时表达增加，并继续向G2期过渡，细胞周期蛋白B1促进G2/M相变，细胞周期蛋白D1促进G1/S相变[25]。该研究过氧化氢通过p53介导的机制诱导细胞周期阻滞在G2/M期，其中p53被激活，p21上调，pRb下调，经过培养后，细胞周期开始进入S期，开始进行DNA复制。免疫荧光定量检测模型组p53、p21表达量高于对照组，共培养组出现降低趋势，这与QPCR检测p53、p21相对表达量相吻合。前期课题组用脐带间充质干细胞移植治疗老年小鼠胸腺时，发现脐带间充质干细胞通过下调衰老基因p53和p16，上调SOD、Sirt1和Sirt3基因[19]，促进胸腺功能再生，推测脐带间充质干细胞可能是通过下调p53细胞通路，阻止Cdk2介导的Rb失活，从而阻止进入细胞周期的S期这一过程逆转，使胸腺上皮细胞开始增殖分裂。
综上所述，脐带间充质干细胞能逆转胸腺上皮衰老、提高衰老胸腺上皮细胞的增殖率，使衰老的胸腺上皮细胞的细胞周期进入S期，降低衰老相关基因的表达，但是具体的关键信号通路、何种关键基因调控还需要进一步的实验验证。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

脐带间充质干细胞对衰老胸腺上皮细胞的作用及影响

Effect of umbilical cord mesenchymal stem cells on aging thymus epithelial cells

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