黄腐酚对内皮祖细胞增殖、迁移、成管及凋亡的影响及机制

doi:10.12307/2021.141

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (31): 4988-4994.doi: 10.12307/2021.141

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

黄腐酚对内皮祖细胞增殖、迁移、成管及凋亡的影响及机制

谭小武1，俞晓凡1，姜慧娇1，刑稚坤1，赵雪源1，高风亦1，吴向未1，陈雪玲2

1石河子大学医学院第一附属医院普外科，新疆维吾尔自治区石河子市 832008；2石河子大学医学院免疫教研室，新疆维吾尔自治区石河子市 832002

收稿日期:2020-08-22 修回日期:2020-08-26 接受日期:2020-09-26 出版日期:2021-11-08 发布日期:2021-04-25
通讯作者: 吴向未，博士，教授，主任医师，石河子大学医学院第一附属医院普外科，新疆维吾尔自治区石河子市 832008
作者简介:谭小武，男，1985年生，湖南省隆回县人，汉族，硕士，主要从事普通外科疾病基础及干细胞转化医学相关研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81760570)，项目负责人：吴向未；国家自然科学基金项目(81760371)，项目负责人：陈雪玲；兵团中青年科技创新领军人才计划项目(2018CB017)，项目负责人：吴向未；兵团重点领域科技公关项目(2019AB031)，项目负责人：陈雪玲

Effect of xanthohumol on proliferation, migration, tube formation and apoptosis of endothelial progenitor cells and its mechanism

Tan Xiaowu1, Yu Xiaofan1, Jiang Huijiao1, Xing Zhikun1, Zhao Xueyuan1, Gao Fengyi1, Wu Xiangwei1, Chen Xueling2

1Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China; 2Department of Immunology, Medical College of Shihezi University, Shihezi 832002, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2020-08-22 Revised:2020-08-26 Accepted:2020-09-26 Online:2021-11-08 Published:2021-04-25
Contact: Wu Xiangwei, MD, Professor, Chief physician, Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Tan Xiaowu, Master, Department of General Surgery, First Affiliated Hospital of Medical College of Shihezi University, Shihezi 832008, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81760570 (to WXW); the National Natural Science Foundation of China, No. 81760371 (to CXL); the Corps Young and Middle-Aged Science and Technology Innovation Leading Talent Program, No. 2018CB017 (to WXW); the Science and Technology Public Relations Project in Key Fields of the Corps, No. 2019AB031 (to CXL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨髓内皮祖细胞：是指来源于骨髓且出生后机体中存在能特异性归巢至血管新生组织并分化成内皮细胞的一群干细胞，表面标物 CD133、CD34及血管内皮生长因子受体2 阳性表达，能够摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白，并能够通过体外培养形成管腔样结构，它不仅参与胚胎时期血管生成，还与损伤的血管内皮愈合和血管新生密切相关。
NF-κB：最早由David Baltimore发现，该蛋白家族可以选择性结合在B细胞κ-轻链增强子上调控许多基因的表达。在几乎所有的动物细胞中都能发现NF-κB，它们参与细胞对外界刺激的响应，如细胞因子、辐射、重金属、病毒等，与多种肿瘤的细胞增殖、侵袭、血管生成和转移有关。
背景：肿瘤的发展依赖于血管新生，以输送氧气和微量营养素，并促使其转移，而肿瘤中的新生血管被认为是由原有血管系统中内皮细胞迁移和增殖形成新的毛细血管。越来越多的证据表明，骨髓源性内皮祖细胞有助于新血管形成，并已成为抗肿瘤治疗的重要靶点。在之前的研究中，未有黄腐酚对骨髓来源内皮祖细胞作用的相关报道。
目的：探讨黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞增殖、迁移、成管以及凋亡的影响，并初步探讨其作用机制。
方法：第3代小鼠骨髓内皮祖细胞分为4组：5，10，20 μmol/L黄腐酚组，以等量二甲基亚砜溶解液为对照组。干预24，48 h，通过CCK-8法测定黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞增殖的影响；干预24 h，划痕实验、Transwell实验检测黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞迁移的影响；干预6 h，成管实验检测黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞管腔形成的影响；干预48 h，流式细胞术、TUNEL凋亡染色法检测黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞凋亡的影响；干预48 h，Western blot法检测黄腐酚对小鼠骨髓内皮祖细胞中血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体2、P65、p-P65蛋白表达的影响。
结果与结论：①黄腐酚干预后，骨髓内皮祖细胞在24，48 h生长半数抑制浓度(IC50)分别为(22.19±0.98)，(11.51±1.25) μmol/L，差异有显著性意义(P < 0.05)，表明黄腐酚可明显抑制骨髓内皮祖细胞的增殖，且具有一定的剂量效应关系(P < 0.05)；②与对照组相比，随着黄腐酚浓度的增大，划痕越明显(P < 0.05)，迁移细胞数逐渐减少(P < 0.05)；③对照组有大量小管样结构形成，而5，10 μmol/L黄腐酚组小管样结构明显减少，20 μmol/L黄腐酚组基本无小管样结构形成，与对照组相比，差异有显著性意义(P < 0.05)；④细胞凋亡率随着黄腐酚浓度升高而上升，具有浓度依赖性，且黄腐酚各组凋亡率均高于对照组(P < 0.05)；⑤与对照组相比，随着黄腐酚浓度的增大，p-P65、血管内皮生长因子表达下降，而血管内皮生长因子受体2呈反馈性升高，具有浓度依赖性(P < 0.05)；⑤结果表明，黄腐酚可抑制骨髓源性内皮祖细胞的增殖、迁移、成管并同时促进其凋亡，其机制可能是通过抑制NF-κB/血管内皮生长因子信号通路，表明黄腐酚具有抗肿瘤血管生成的潜能。

https://orcid.org/0000-0002-5719-3822(谭小武) ；https://orcid.org/0000-0002-3897-6629(吴向未)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨髓, 内皮祖细胞, 黄腐酚, 血管内皮前体细胞, 血管生成, NF-κB, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: The development of tumor depends on angiogenesis to transport oxygen and micronutrients, and promote its metastasis. The neovessels in tumor is considered to be the new capillaries formed by the migration and proliferation of endothelial cells in the original vascular system. More and more evidence shows that bone marrow-derived endothelial progenitor cells contribute to neovascularization and have become an important target for anti-tumor therapy. In previous studies, there was no report about the effect of xanthohumol on bone marrow-derived endothelial progenitor cells.
OBJECTIVE: To study the effects of xanthohumol on the proliferation, migration, tube formation and apoptosis of bone marrow-derived endothelial progenitor cells, and to preliminarily explore its mechanism of action.
METHODS: The third passage of bone marrow-derived endothelial progenitor cells were divided into four groups: 5, 10, 20 μmol/L xanthohumol group and the same amount of dimethyl sulfoxide solution as the control group. After intervention for 24 and 48 hours, effect of xanthohumol on the proliferation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells was measured by the CCK-8 method. After intervention for 24 hours, the scratch test and the Transwell test were used to detect the effect of xanthohumol on the migration of mouse bone marrow-derived endothelial progenitor cells. After intervention for 6 hours, the tube test was used to detect the effect of xanthohumol on the lumen formation of mouse bone marrow-derived endothelial progenitor cells. After intervention for 48 hours, flow cytometry and TUNEL assay were applied to detect the effect of xanthohumol on the apoptosis of mouse bone marrow-derived endothelial progenitor cells. After intervention for 48 hours, western blot assay was employed to detect the effect of xanthohumol on vascular endothelial growth factor, vascular endothelial growth factor receptor 2, P65 and p-P65 protein.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After the intervention of xanthohumol, the half maximal inhibitory concentration (IC50) of bone marrow-derived endothelial progenitor cells at 24 and 48 hours were (22.19±0.98) and (11.51±1.25) μmol/L, respectively. The comparison between them was statistically significant (P < 0.05), indicating that xanthohumol could significantly inhibit the proliferation of bone marrow-derived endothelial progenitor cells in a certain dose-effect relationship (P < 0.05). (2) Compared with the control group, as the concentration of xanthohumol increases, the scratches were more obvious (P < 0.05), and the number of migrating cells decreased gradually (P < 0.05). (3) A large number of tubule-like structures were formed in the control group, while the tubule-like structures were significantly reduced in the 5 and 10 μmol/L xanthohumol groups, and no tubule-like structures were formed in the 20 μmol/L xanthohumol group, with significant difference compared with the control group (P < 0.05). (4) The apoptosis rate was significantly increased after xanthohumol treatment in a concentration-dependent manner, and the apoptosis rate in each xanthohumol group was significantly higher than that in the control group (P < 0.05). (5) Compared with the control group, with the increase of xanthohumol concentration, the expression of p-P65 and vascular endothelial growth factor decreased, while vascular endothelial growth factor receptor 2 increased in a concentration-dependent manner (P < 0.05). (6) These results indicate that xanthohumol can inhibit the proliferation, migration, tube formation and apoptosis of bone marrow-derived endothelial progenitor cells. The mechanism may be through the inhibition of NF-κB/vascular endothelial growth factor signaling pathway, indicating that xanthohumol has the potential of anti-tumor angiogenesis.

Key words: bone marrow, endothelial progenitor cells, xanthohumol, vascular endothelial progenitor cells, angiogenesis, NF-κB, signaling pathway

中图分类号:

谭小武, 俞晓凡, 姜慧娇, 刑稚坤, 赵雪源, 高风亦, 吴向未, 陈雪玲. 黄腐酚对内皮祖细胞增殖、迁移、成管及凋亡的影响及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(31): 4988-4994.

Tan Xiaowu, Yu Xiaofan, Jiang Huijiao, Xing Zhikun, Zhao Xueyuan, Gao Fengyi, Wu Xiangwei, Chen Xueling. Effect of xanthohumol on proliferation, migration, tube formation and apoptosis of endothelial progenitor cells and its mechanism[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(31): 4988-4994.

图/表（结果） 8

2.1 骨髓源性内皮祖细胞的特征 EGM-2MV完全培养基培养第7天获得的细胞呈梭形，为内皮细胞样形态，见图1A；90%的贴壁细胞表现出摄取Dil-ac-LDL，同时与FITC-UEA-lectin结合，见图1B，这是内皮祖细胞的重要特征[24]。此外，研究还发现这些细胞表达内皮标志物血管内皮生长因子受体2、CD34和CD133，见图1C。

2.2 黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞增殖的影响见图2。不同浓度的黄腐酚(0，5，7.5，10，20，40 μmol/L)作用于骨髓源性内皮祖细胞24，48 h后，细胞增殖抑制率明显升高，并表现出浓度依赖性和时间依赖性。

2.3 黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞迁移的影响划痕实验显示，随着黄腐酚浓度的增大，骨髓源性内皮祖细胞的划痕越明显(F=62.79，两两比较均P < 0.05)，且20 μmol/L黄腐酚作用最为明显，提示黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞具有杀伤作用，见图3。

Transwell检测结果显示，与对照组相比，5，10，20 μmol/L黄腐酚组骨髓源性内皮祖细胞的迁移能力随着浓度的升高，迁移细胞数逐渐减少，差异有显著性意义(F=251.79，两两比较均P < 0.05)，见图4。

2.4 黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞小管形成的影响培养4-6 h后镜下观察可见：对照组有大量小管样结构形成，而5，10 μmol/L黄腐酚组小管样结构明显减少，20 μmol/L黄腐酚组最为明显，基本上无小管样结构形成，与对照组相比，差异有显著性意义(F=198.87，两两比较均P < 0.05)，见图5。

2.5 流式细胞术检测黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞凋亡的影响用不同浓度黄腐酚(0，5，10，20 μmol/L)作用于骨髓源性内皮祖细胞48 h后，凋亡率分别为(8.25±1.31)%，(12.63±0.62)%，(20.47±0.57)%，(30.43±0.66)%，细胞凋亡率随着黄腐酚浓度升高而上升，具有浓度依赖性，且黄腐酚各组凋亡率均高于对照组，差异有显著性意义(F=393.45，两两比较均P < 0.05)，见图6。

2.6 TUNEL凋亡染色检测黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞凋亡的影响使用TUNEL凋亡染色法，并通过显微镜高倍视野下计算凋亡指数，如图7所示，对照组与各浓度(5，10，20 μmol/L)黄腐酚组细胞凋亡指数分别为(2.99±0.46)%，(7.56±0.50)%，(30.28±1.57)%，(67.79±4.14)%，20 μmol/L黄腐酚组凋亡率最高，有浓度依赖性，且黄腐酚各组凋亡率均高于对照组，差异有显著性意义(F=521.64，两两比较均P < 0.05)。

2.7 Western blot 检测黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞中血管内皮生长因子、P65、p-P65及血管内皮生长因子受体2蛋白表达的影响黄腐酚处理后与对照组相比，血管内皮生长因子、p-P65蛋白表达逐渐下降，血管内皮生长因子受体2蛋白表达逐渐增高(均P < 0.05)，具有浓度依赖性(均P < 0.05)，见图8。

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引言

由于目前治疗的局限性，癌症仍然是人类死亡的主要原因，中国恶性肿瘤发病率为285.83/10万[1]。手术、放疗和化疗是常用的治疗癌症的方法，尽管治疗策略有了重大进展，癌症仍然是一个影响人类健康的公共卫生问题。肿瘤的发展依赖于血管新生，以输送氧气和微量营养素，并促使其转移，而肿瘤中的新生血管被认为是由原有血管系统中内皮细胞迁移和增殖形成新的毛细血管[2]。然而，越来越多的证据表明，骨髓源性内皮祖细胞也有助于新血管形成[3]。据报道，内皮祖细胞可主动迁移到肿瘤床，并以高度特异性的方式植入新生血管[4]。因此，介导新生血管的内皮祖细胞可能是肿瘤生长和扩散的关键因素，并已成为抗肿瘤治疗的重要靶点[5-6]。
中医学已经有几千年的历史，在初级卫生保健中占有重要地位，被西方国家视为现代药物先导分子的丰富来源[7]。据报道，中药中的各种活性成分对肿瘤细胞具有抗增殖作用，是提高人类癌症化疗疗效的有效药物[8]。黄腐酚是从酒花中分离纯化的一种异戊烯黄酮类化合物，大量的体外和体内研究揭示了黄腐酚具有抗癌活性[9-10]，并通过NF-κB通路抑制血管生成[11]。NF-κB通路可参与肿瘤发生和发展的多个方面，包括调控细胞凋亡、细胞周期、细胞分化、血管新生和细胞迁移等[12]。该研究从小鼠骨髓中提取原代内皮祖细胞，在细胞、分子水平上探讨黄腐酚对内皮祖细胞存活、迁移、成管及凋亡的影响，并从NF-κB/血管内皮生长因子通路对其作用机制进行初步分析，以期为肿瘤的治疗提供新的思路。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年7月在石河子大学新疆地方与民族高发病重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康4-6周龄C57BL/6小鼠30只，雌雄各半，体质量18-22 g，购于新疆医科大学动物实验中心，饲养在 SPF 级实验动物房，动物合格证号： SYXK (新) 2018-0003。
1.3.2 实验药物、试剂、仪器黄腐酚(含量> 99%，美国APExBIO公司，货号：A8630)；DMEM低糖培养基(美国Life-Gibco公司，货号：8119304)；胎牛血清(以色列Biological Industries公司，货号：1805172)；人纤连蛋白(美国Life-Gibco公司，货号：PEP-0875)；EGM-2MV(美国LONZA公司，货号：CC-3156)；胰蛋白酶(美国Life-Gibco公司，货号：25200-056)；FITC-UEA-lectin(美国Sigma公司，货号：L2895-2MG)；Dil-ac-LDL(广州奕元生物技术有限公司，货号：YB-0013)；DAPI溶液即用型(北京索莱宝生物公司，货号：C0065)；40 g/L多聚甲醛(北京索莱宝生物公司，货号：P1110)；青链霉素(北京索莱宝生物公司，货号：P1400)；二甲基亚砜(北京索莱宝生物公司，货号：D8370)；Matrigel基质胶(美国BD公司，货号：356234)；抗血管内皮生长因子A抗体、抗CD34抗体、抗CD133抗体、抗血管内皮生长因子受体2抗体、抗NF-κBP65Phospho-P65抗体(美国Abcam公司，货号：1316，81289，216323，11939，16502，183559)；免疫荧光二抗(北京中杉金桥公司，货号：ZF-0316)；Transwell小室(美国康宁公司，货号：3421)；结晶紫染料(美国eBioscience公司，货号：1218)；CCK-8试剂盒(东仁化学科技有限公司，货号：CK12)；TUNEL检测试剂盒(碧云天生物科技公司，货号：C1089)；AnnexinV-FITC染色凋亡检测试剂盒(联科公司，货号：AP101)；荧光倒置显微镜(德国Zeiss公司，IX73)；Immonilon Western化学发光试剂(德国Millipore公司，S0100)；倒置显微镜(德国Leica 公司，DFC450C)。
1.3.3 黄腐酚溶液的配置将黄腐酚振荡溶解于少量二甲基亚砜中，配成25 mmol/L的溶液，过滤后保存于-80 ℃冰箱。使用时，用EGM-2MV完全培养液稀释黄腐酚溶液至所需浓度，观察无沉淀，二甲基亚砜终浓度< 0.1%。
1.4 实验方法
1.4.1 原代小鼠骨髓源性内皮祖细胞的分离和培养采用改良差时贴壁法进行骨髓源性内皮祖细胞的分离、培养[13-17]。取4-6周龄的C57BL/6小鼠，脱颈处死，体积分数为75%乙醇浸泡消毒5 min，在无菌操作下用手术器械分离出小鼠的双侧股骨和胫骨，剔除肌肉和筋膜；用5 mL注射器抽取低糖DMEM完全培养基，换用1 mL注射器的针头，把全骨髓细胞冲至60 mm无菌培养皿中，吹打均匀，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱内培养，48 h后轻晃培养皿，收集未贴壁细胞，用EGM-2MV完全培养基在预先用人纤连蛋白包埋好的无菌培养皿中继续培养，2 d换液1次，原代培养细胞至80%-90%融合时按1∶2传代。
1.4.2 小鼠骨髓源性内皮祖细胞的鉴定据文献[18-20]方法，取EGM-2MV完全培养基培养7 d的细胞，无菌PBS轻洗1次，用胰酶消化细胞后计数(1×1010 L-1)，选择合择的细胞密度种于铺有细胞爬片的24孔板中，加入一抗(CD133、CD34、FITC-UEA-Iectin、Dil-Ac-LDL用培养基按1∶150稀释、血管内皮生长因子受体2用培养基按1∶200稀释) 4 ℃孵育过夜，加入抗Alexa Fluor 647-FITC二抗(1∶200稀释)孵育1 h，最后即用型DAPI在避光下染细胞核，荧光显微镜下观察、拍照。

1.5 主要观察指标
1.5.1 CCK-8实验检测黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞的增殖抑制情况取第3代对数生长期骨髓源性内皮祖细胞，按1×104/孔将细胞悬液接种于96孔板中，置于37 ℃培养箱中培养过夜待细胞贴壁，分别加入含黄腐酚的EGM-2MV培养基100 μL，调整终浓度分别为5，7.5，10，20，40 μmol/L，设置空白组(仅加入EGM-2MV培养基)及对照组(加入骨髓源性内皮祖细胞和EGM-2MV培养基)，每组设置5个复孔，培养24，48 h后向各孔中避光加入CCK-8溶液10 μL，放入培养箱中继续培养1-4 h，待颜色变化明显时，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度值(A值)，细胞抑制率=(A对照孔-A实验孔)/(A对照孔-A空白孔)×100%。实验重复3次。
1.5.2 细胞划痕实验动态观察黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞迁移的影响参考文献[21]方法，取第3代对数生长期骨髓源性内皮祖细胞，适度密度(3×105/孔)接种于6孔板中，等细胞生长到80%融合时，用高压消毒过的直尺为固定工具，用200 μL枪头沿着直尺在单层细胞上划痕，PBS洗去已脱落细胞，更换培养基(含体积分数为1%胎牛血清的EGM-2MV培养基)，并加入相应浓度的黄腐酚(5，10，20 μmol/L)，设置对照组(加入0.1%二甲基亚砜)，分别于0，24 h在倒置显微镜下观察并拍照并用Image Pro Plus分析。实验重复3次。
1.5.3 Transwell实验观察黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞迁移的影响参考文献[21]方法，取第3代对数生长期骨髓源性内皮祖细胞，设对照组(0.1%二甲基亚砜)及不同浓度(5，10，20 μmol/L)黄腐酚组。在Transwell的上室中加不含血清的EGM-2MV培养基在培养箱中过夜，然后Transwell上室中加入200 μL含体积分数为1%胎牛血清的EGM-2MV培养基稀释的骨髓源性内皮祖细胞悬液(1×105/孔)及不同浓度的黄腐酚或二甲基亚砜，下室中加入500 μL含体积分数为1%胎牛血清的EGM-2MV培养基及相应浓度的黄腐酚或二甲基亚砜，放入培养箱中培养24 h，取出小室，PBS冲洗3遍，湿润棉签轻擦拭上室细胞，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS轻洗3遍，结晶紫染色，倒置显微镜下观察10个视野并用Image J计数。实验重复3次。
1.5.4 小管形成实验观察黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞小管形成的影响参考文献[22]方法，取50 μL Matrigel胶铺于96孔板中，注意不要产生气泡，置于37 ℃培养箱中2 h，取骨髓源性内皮祖细胞，设对照组(0.1%二甲基亚砜)及不同浓度(5，10，20 μmol/L)黄腐酚组，用含体积分数为1%胎牛血清的EGM-2MV培养基重悬内皮祖细胞，用计数板计数，每孔接种细胞悬液100 μL (1×105个细胞)，同时加入不同浓度(5，10，20 μmol/L)黄腐酚或二甲基亚砜，培养6 h后于倒置显微镜下观察并拍照，用Image Pro Plus定量分析。实验重复3次。
1.5.5 流式细胞仪检测黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞凋亡的影响收集第3代对数生长期骨髓源性内皮祖细胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，将适量密度的细胞均匀铺于6 cm培养皿中(5×105/孔)，设对照组(0.1%二甲基亚砜)及不同浓度(5，10，20 μmol/L)黄腐酚组，处理48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，然后1 000 r/min离心5 min收集细胞沉淀，PBS洗涤2次，按照试剂盒说明操作：将细胞重悬于150 μL Binding Buffer中，同时加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光孵育30 min，在1 h内上流式细胞仪检测。实验重复3次。
1.5.6 TUNEL细胞凋亡染色观察黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞凋亡的影响参考文献[23]方法，收集第3代对数生长期骨髓源性内皮祖细胞，设对照组(0.1%二甲基亚砜)及不同浓度(5，10，20 μmol/L)黄腐酚组，24孔板细胞爬片并黄腐酚处理48 h后，依据TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明操作：PBS洗涤1次，用40 g/L多聚甲醛固定细胞30 min，再用PBS洗涤1次，加入含0.1%Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min，PBS洗涤2次，加入50 μL TUNEL检测液，在37 ℃条件下避光孵育约60 min，PBS洗涤3次，即用型DAPI染核，甘油封固后荧光显微镜下观察并拍照。凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。实验重复3次。
1.5.7 Western blot检测黄腐酚对骨髓源性内皮祖细胞中血管内皮生长因子、P65、p-P65及血管内皮生长因子受体2蛋白表达的影响收集第3代对数生长期骨髓源性内皮祖细胞，设对照组(0.1%二甲基亚砜)及不同浓度(5，10，20 μmol/L)黄腐酚组，干预处理48 h后，PBS洗涤1次，加入150 μL含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，细胞刮匙刮下细胞，冰上裂解15 min，在4 ℃离心机中14 000 r/min离心20 min，收集上清，BCA法蛋白定量并配平，加入1/4体积的5×lodading buffer，100 ℃煮沸6 min使蛋白变性，并于
-20 ℃冰箱保存备用。首先SDS-PAG(6%-10%)电泳分离蛋白，湿转膜法将目的蛋白转移到PVDF膜上，并用TBST(含5%牛血清白蛋白)将转好的膜封闭2 h，加入一抗(β-actin抗体、血管内皮生长因子受体2抗体、血管内皮生长因子抗体、P65抗体、p-P65抗体，均1∶1 000稀释)于摇床上4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，加入二抗孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，暗室曝光，采用Image pro plus软件对条带进行灰度分析。实验重复3次。
1.6 统计学分析所得数据使用SPSS 22.0软件进行统计分析，结果以x±s表示，多组之间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，多个实验组与对照组之间的比较采用Dunnett法，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

肿瘤血管生成是指在实体肿瘤中形成新的血管，以供应营养物质和氧气，从而促进肿瘤细胞的扩散[26]，它发生在肿瘤的生长和发展过程中，是肿瘤转移的关键步骤[27]。众所周知，抗血管治疗是抑制肿瘤生长的重要途径，且骨髓来源内皮祖细胞是肿瘤新生血管的重要组成部分，因此，内皮祖细胞是抗肿瘤治疗的重要靶点。在之前的研究中，未有黄腐酚对骨髓来源内皮祖细胞作用的相关报道。该研究结果显示，黄腐酚抑制了骨髓内皮祖细胞的增殖、迁移和成管能力，同时促进了凋亡，表现出浓度依赖性，且下调了NF-κB和血管内皮生长因子的表达。这与ALBINI等[28]的研究结果一致，黄腐酚在体外具有抑制血管生成的作用。
据报道，NF-κB激活参与肿瘤发生和发展的多个方面，包括控制细胞凋亡、促血管新生、细胞周期、分化和细胞迁移[29]，阻断NF-κB的激活可以起到抑制肿瘤生长的作用。目前已知的NF-κB家族有5个成员：p50/p105，p52/p100，p65，c-Rel和RelB，并且NF-κB复合物被抑制性IκB蛋白隔离在细胞质中。受到刺激后，IκB通过泛素-蛋白质组途径迅速磷酸化和降解，导致NF-κB的释放，使NF-κB成员在细胞核中积累[30]。此外，SAITO等[11]报道黄腐酚通过抑制NF-κB的激活对胰腺癌血管生成具有抑制作用。Western blot分析结果显示，黄腐酚降低了骨髓源性内皮祖细胞中磷酸化p65的水平，这提示黄腐酚可能通过抑制NF-κB发挥抗血管生成作用。
血管生成是正常和病理过程的关键，在癌症的生长和扩散中起着重要作用。一旦形成新的血管，癌细胞就会获得更多的氧气和营养物质，并侵入附近的组织，扩散到身体的其他部位。已有研究表明，NF-κB调控血管生成相关分子的表达，如血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶2、基质金属蛋白酶9和内皮型一氧化氮合酶的表达[31-32]。越来越多的证据已经确立了血管内皮生长因子作为正常和异常血管生成关键调节因子的基础作用[33]。血管内皮生长因子强烈刺激内皮细胞迁移、增殖和新血管的形成。在生理和病理情况下，血管内皮生长因子失活已被证明会导致血管系统的退化[33]。Western blot结果表明黄腐酚可以下调血管内皮生长因子的表达和抑制血管生成，血管内皮生长因子受体2的表达增高，表明黄腐酚可能通过抑制NF-κB通路来抑制血管内皮生长因子的表达，进而抑制血管生成。
该研究只进行了体外实验，未对NF-κB和血管内皮生长因子进行过表达研究来观测黄腐酚的抗血管作用，同时未进行体内实验加以验证。研究报道血管生成还与JAK2/STAT3及Notch1通路有关[34-35]，故后续应行更多实验，进一步探讨黄腐酚抑制血管生成的具体机制。总之，该研究发现黄腐酚在体外具有抗血管生成作用，这种作用可能与抑制NF-κB/血管内皮生长因子通路有关，这为抗肿瘤治疗提供了理论支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

黄腐酚对内皮祖细胞增殖、迁移、成管及凋亡的影响及机制

Effect of xanthohumol on proliferation, migration, tube formation and apoptosis of endothelial progenitor cells and its mechanism

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