生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因bax、bcl-2 mRNA的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.27.014

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：
心肌缺血再灌注损伤：指心肌组织在遭受缺血、缺氧性损伤一定时间后恢复血液灌流，不仅不能使心肌组织功能恢复，反而使缺血心肌发生比再灌注前更严重的损伤。虽然早期恢复血液灌注是减轻心肌组织缺血性损伤的一种重要手段，但由于血流恢复再灌注后，中性粒细胞大量黏附、聚集并在心肌组织浸润，加上大量氧自由基的生成以及钙超载、高能磷酸化合物缺乏、内皮素的作用下，使心肌组织损伤更加严重。
细胞凋亡：为了维持内环境稳定，由基因控制的活体内个别细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡在形态和生化特征上与细胞坏死都有不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程，在成熟细胞新旧交替、萎缩、老化、炎症等生理、病理过程中都发挥了不可替代的作用。

摘要
背景：生黄合剂由中药生脉饮和黄芩茎叶总黄酮组成，已有研究表明其通过抗炎、调节免疫功能等对心肌缺血有保护作用，但对缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的作用机制尚未阐明。
目的：探讨生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因bcl-2、bax mRNA表达的影响。
方法：将36只SD大鼠随机分为6组，即生黄合剂低、中、高剂量组、阳性药物对照组、空白组、模型组，每组6只，分别给药7 d后，建立心肌缺血再灌注损伤模型。用TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，RT-PCR法检测缺血再灌注区心肌bax、bcl-2 mRNA的表达。
结果与结论：①与模型组比较，生黄合剂治疗组bcl-2 mRNA表达显著升高(P < 0.05)，bax mRNA表达显著降低(P < 0.05)，使bcl-2/bax比值升高，心肌细胞凋亡指数明显降低(P < 0.05)；②结果证实，生黄合剂对大鼠心肌组织缺血再灌注有保护作用，其机制可能是通过上调bcl-2 mRNA的表达、下调bax mRNA的表达，提高bcl-2/bax比值，从而起到抑制心肌细胞凋亡。

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ORCID: 0000-0003-0243-2424(陈龙)

关键词: 实验动物, 心肺及血管损伤动物模型, 生黄合剂, 大鼠, 心肌缺血再灌注, 细胞凋亡, bcl-2基因, bax基因

Abstract:

BACKGROUND: Sheng-Huang mixture including Chinese medicine Shengmai Decoction and total flavonoids of stems and leaves of radix has been shown to resist inflammation, regulate immune function, and protect ischemic myocardial tissues. However, its effect on the apoptosis of cardiac muscle cells after ischemia/reperfusion injury remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the effects of Sheng-Huang mixture on cardiocyte apoptosis and bax and bcl-2 mRNA expression in rats with ischemia-reperfusion injury.
METHODS: Thirty-six Sprague-Dawley rats were divided randomly into six groups: low-dose, moderate-dose and high-dose Sheng-Huang mixture, positive control, blank and model groups (n=6). After 7 days of administration, models of myocardial ischemia-reperfusion injury were established. TUNEL was used to detect myocardial apoptosis. RT-PCR was utilized to measure bax and bcl-2 mRNA expression in the ischemic and reperfusion region.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The bcl-2 mRNA expression was significantly higher in the Sheng-Huang mixture group than in the model group (P < 0.05), but bax mRNA expression was significantly lower (P < 0.05). Thus, bcl-2/bax ratio increased. In addition, apoptosis index was more significantly decreased in the Sheng-Huang mixture group (P < 0.05). (2) Results demonstrated that Sheng-Huang mixture can protect rat myocardium against ischemia/reperfusion injury, and effectively increase the bcl-2/bax ratio and inhibit the apoptosis of cardiomyocytes, and the underlying mechanism is mediated by up-regulating bcl-2 mRNA expression and down-regulating bax mRNA expression.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

Key words: Myocardial Ischemia, Apoptosis, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

陈龙，田焕娜，高玉峰. 生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因bax、bcl-2 mRNA的影响[J]. 中国组织工程研究, 2016, 20(27): 4049-4054.

Chen Long, Tian Huan-na, Gao Yu-feng. Influence of Sheng-Huang mixture on cardiocyte apoptosis and bax and bcl-2 mRNA expression in a rat model of ischemia-reperfusion injury[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2016, 20(27): 4049-4054.

图/表（结果） 1

参考文献

[1] 李健,冯义柏,郎明健.吡格列酮预处理对大鼠心脏缺血再灌注/缺氧再复氧线粒体结构及膜电势的影响[J].中国病理生理杂志,2008, 24(4):720-724.
[2] 邓宇珺,符永恒,谭宁,等.大鼠活体心肌缺血再灌注损伤模型的建立与综合评估[J].中国病理生理杂志,2011,27(2): 412-416.
[3] 薛富善,孙海燕,李平,等.细胞凋亡与心肌缺血再灌注损伤[J].中国医药导刊,2007,9(4):335-339.
[4] Dianat M, Hamzavi GR, Badavi M, et al. Effects of losartan and vanillic Acid co-administration on ischemia-reperfusion-induced oxidative stress in isolated rat heart. Iran Red Crescent Med J. 2014; 16(7):e16664.
[5] Montero MF, Saurim R, Bonservizi WG, et al. Heart injury following intestinal ischemia reperfusion in rats is attenuated by association of ischemic preconditioning and adenosine. Acta Cir Bras. 2014;29 Suppl 2:67-71.
[6] Wang G, Jiang L, Song J, et al. Mipu1 protects H9c2 myogenic cells from hydrogen peroxide-induced apoptosis through inhibition of the expression of the death receptor Fas. Int J Mol Sci. 2014;15(10):18206- 18220.
[7] Saeed SA, Waqar MA, Zubairi AJ, et al. Myocardial ischaemia and reperfusion injury: reactive oxygen species and the role of neutrophil. J Coll Physicians Surg Pak. 2005;15(8):507-514.
[8] Kovacevi? M, Simi? O, Jonji? N, et al. Apoptosis and cardiopulmonary bypass. J Card Surg. 2007;22(2): 129-134.
[9] Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioning. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003;285(2):H579- 588.
[10] 郝金凤,郭亚春.生黄合剂对病毒性心肌炎小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞影响的研究[J].现代免疫学,2015, 35(4):294-298.
[11] 高玉峰,张凤英,米术斌. 生黄合剂对病毒性心肌炎小鼠的干预实验[J]. 中国临床康复,2006,10(35):51-53.
[12] 周晓春,颜勇,王宝忠,等. 生黄合剂对病毒性心肌炎小鼠血清SOD 活性和MDA 含量的影响[J]. 承德医学院学报,2008,25(1):10-11.
[13] 郭亚春,周晓春,宋鸿儒,等. 黄芩茎叶总黄酮与生脉饮对病毒性心肌炎心脏细胞因子mRNA 表达的影响[J]. 山东医药,2008,48(2):46-48.
[14] 张凤英,高玉峰,宋鸿儒.黄芩茎叶提取物与生脉饮抗柯萨奇病毒B3的体外研究[J]. 天津医药,2005,33(11): 716-718.
[15] Lindsten T, Ross AJ, King A, et al. The combined functions of proapoptotic Bcl-2 family members bak and bax are essential for normal development of multiple tissues. Mol Cell. 2000;6(6):1389-1399.
[16] 刘胜辉,杨新春,范谦.缺血后处理对大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡的影响[J].中国组织工程研究与临床康复, 2007, 11(8):1450-1452.
[17] 陈燕,夏豪,鲍翠玉,等.心肌缺血再灌注损伤模型大鼠心肌组织及血清肌钙蛋白Ⅰ表达和心肌肿瘤坏死因子α与重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的干预[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2011,11(37): 6879-6882.
[18] 解丽君,张建新,李兰芳,等.异丙酚激活蛋白激酶C 对心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2007,11(29): 5735-5741
[19] 张慧芝,白建平,于肯明.芹菜素对缺血再灌注大鼠心肌核转录因子-κ B和ICAM-1表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2010,19(2):181-184.
[20] Xie Z, Koyama T, Suzuki J, et al. Coronary reperfusion following ischemia: different expression of bcl-2 and bax proteins, and cardiomyocyte apoptosis. Jpn Heart J. 2001;42(6):759-770.
[21] 赵永强,隽兆东,管英俊,等.PI3K与ERK1/2信号传导通路在吡格列酮保护大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用机制[J].中国实验诊断学,2012,16(2):207-210.
[22] 贺欣,陶贵周,齐志敏.葡萄糖酸镁对离体大鼠心肌缺血再灌注细胞凋亡的抑制效应[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(8):1465-1468.
[23] Yang B, Johnson TS, Thomas GL, et al. Expression of apoptosis-related genes and proteins in experimental chronic renal scarring. J Am Soc Nephrol. 2001;12(2): 275-288.
[24] McClintock DS, Santore MT, Lee VY, et al. Bcl-2 family members and functional electron transport chain regulate oxygen deprivation-induced cell death. Mol Cell Biol. 2002;22(1):94-104.
[25] 刘静,牛鹏武.川芎嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响[J].中国实用医药,2011,6(2):29-30.
[26] 李波,杨萌,刘景伟,等. HRS调控凋亡相关蛋白Bcl-xL、Bad、Bcl-2、Bax对大鼠心肌缺血再灌注损伤影响[J].中国公共卫生,2015,31(7):889-892.
[27] 赵润英,郝伟,孟祥军,等.阿魏酸川芎嗪对缺血再灌注大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响[J].中国病理生理杂志,2013,29(12):2139-2143.
[28] 陈文娟,胡道德,刘亮.中药治疗病毒性心肌炎的实验研究进展[J].中国中西医结合杂志,2013,33(10):1438-1440.
[29] Galagudza M, Kurapeev D, Minasian S, et al. Ischemic postconditioning: brief ischemia during reperfusion converts persistent ventricular fibrillation into regular rhythm. Eur J Cardiothorac Surg. 2004;25(6): 1006-1010.
[30] Gottlieb RA, Burleson KO, Kloner RA, et al. Reperfusion injury induces apoptosis in rabbit cardiomyocytes. J Clin Invest. 1994;94(4):1621-1628.
[31] Kajstura J, Cheng W, Reiss K, et al. Apoptotic and necrotic myocyte cell deaths are independent contributing variables of infarct size in rats. Lab Invest. 1996;74(1):86-107.
[32] 周晓慧,龚明玉,杨鹤梅,等. 黄芩茎叶总黄酮对缺血/复氧诱导心肌细胞凋亡的影响[J].中国中西医结合杂志,2011, 31(6):803-806.
[33] 卜丽梅,关凤英,乔萍,等.没食子酸对大鼠缺血再灌注损伤后细胞凋亡的保护作用及作用机制[J].中国实验诊断学, 2010,14(11):1693-1697.
[34] 闫文翠,王晶,张维娜,等.生黄合剂对大鼠心肌缺血再灌注损伤的干预作用[J].中国老年学杂志,2013,33(23): 5893-5895.
[35] Pchejetski D, Kunduzova O, Dayon A, et al. Oxidative stress-dependent sphingosine kinase-1 inhibition mediates monoamine oxidase A-associated cardiac cell apoptosis Circ Res. 2007;100(1):41-49.
[36] 贺苗,赵杰,苏健,等. 1-磷酸鞘氨醇后适应对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J].中国药理学通报,2013, 29(10):1369-1372.

引言

材料方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康SD雄性大鼠36只，140 d龄，体质量200-350 g，购于北京大学医学部实验动物科学部。

1.1.2 主要试剂 黄芩茎叶总黄酮(承德医学院中药研究所)，生脉饮(吉林敖东药业集团有限公司)，复方丹参滴丸(广州白云山制药总厂)，TUNEL试剂盒(罗氏诊断产品有限公司)，RT-PCR试剂盒(Takara公司)，Bax、Bcl-2兔抗鼠多克隆抗体(美国Santa公司)，Trizol总RNA提取试剂(Invitrogen公司)，琼脂糖(美国Santa公司)，引物及内参(上海生工生物工程公司)，DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术开发有限公司)，DNA Marker(大连宝生物公司，溴化乙锭(GIBRO公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组、给药 健康SD大鼠36只，随机分为6组，每组6只。生黄合剂低、中、高剂量组在手术前7 d开始按5 mL/(kg•d)灌胃不同剂量的生黄合剂(5 mL/kg生脉饮分别溶解黄芩茎叶总黄酮18，36，72 mg/kg)。空白组、模型组给予相同体积生理盐水。阳性药物对照组按135 mg/kg给予复方丹参滴丸。给药结束后，空白组分离冠状动脉左前降支后只穿线不结扎，30 min后将线拨出，其他各组分离左冠状动脉前降支，结扎30 min，然后剪断结扎线，再灌注2 h。

1.2.2 制备心肌缺血再灌注损伤模型 3 g/L戊巴比妥钠按10 mL/kg的剂量对大鼠进行腹腔注射麻醉，取仰卧位固定，颈部正中切口，气管插管，小型呼吸机控制呼吸；胸部消毒剃毛，于左胸3至4肋间切开胸壁，暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支，结扎30 min；然后剪断结扎线，再恢复血流灌注2 h，空白组分离冠状动脉左前降支后只穿线不结扎，30 min后将线拔出，实验中观察心尖部颜色改变及心电图变化，以心电图ST段明显抬高，左心室前壁心肌发绀为成功阻断冠状动脉左前降支的标志，以ST段逐渐回落50%以上，梗死性Q波出现，心尖部颜色由紫绀逐渐变红润为再灌注成功的标志，否则给予剔除^[15-19]。

1.2.3 心肌细胞凋亡的检测 造模结束后迅速摘取心脏，用生理盐水冲洗血渍，取左心室缺血部位心肌40 g/L多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋；常规石蜡切片、切片脱蜡至水、PBS漂洗3×5 min、蛋白酶K工作液37 ℃反应10 min、40 g/L多聚甲醛室温固定15 min、PBS漂洗3×5 min、50 μL TUNEL反应液37 ℃孵育60 min、PBS漂洗3×5 min、50 μL POD 37 ℃孵育30 min、PBS漂洗3×5min、DAB显色3-10 min、纯水漂洗3×5 min、苏木精复染8 min、流水冲洗、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固；显微镜观察拍照，正常的心肌细胞核形状似椭圆或长杆状，呈蓝色；凋亡细胞染色质出现浓缩、边缘化，有的核膜破裂，核呈深浅不一的棕黄色或棕褐色。每张切片在400倍光镜下随机采集10个视野，对细胞凋亡指数进行计算，凋亡指数=凋亡细胞总数/细胞总数×100%。

1.2.4 RT-PCR法检测bcl-2、bax mRNA的表达 取各组大鼠缺血再灌注区的心肌组织100 mg，每份加入1 mL Trizol提取液，按照试剂提取操作说明书进行RNA提取，琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的含量、纯度及完整性；反转录PCR反应，RT-PCR仪进行PCR扩增，检测缺血再灌注区心肌组织中bcl-2、bax mRNA表达水平。cDNA合成条件：30 ℃ 10 min，42 ℃ 30 min，99 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，bcl-2扩增条件为：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；bax扩增条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，28个循环；PCR扩增内参照β-actin：94℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃1 min，30个循环。

1.3 主要观察指标 各组心肌细胞凋亡情况，心肌组织bcl-2、bax mRNA的表达。

1.4 统计学分析 采用统计学软件SPSS17.0对数据进行分析处理，单因素方差分析进行多组间数据比较，LSD法进行两两组间数据比较，P < 0.05 为差异有显著性意义。

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讨论

心肌缺血再灌注可诱导细胞凋亡，细胞凋亡是心肌缺血再灌注导致心肌细胞死亡的重要机制之一^[20-21]，其发生发展的过程受到多种基因调控，其中抑制凋亡基因bcl-2作为线粒体途径凋亡信号通路中关键的家族蛋白是调解凋亡基因家族的主要成员，Bcl-2是一种膜整合蛋白，主要分布于线粒体内膜、细胞内膜表面、内质网、核膜等，bcl-2的高度表达能抑制多种诱导因素引起的细胞凋亡，bcl-2基因家族是一类结构相似包括两类功能相反的基因，bcl-2是一种抑制细胞凋亡的基因。bax基因属于bcl- 2基因家族成员，其功能与bcl-2 基因相反，是一种促进细胞凋亡的基因^[22-24]。其通过促进细胞色素C的释放从而促进细胞凋亡，有学者提出细胞内bcl-2和bax的比值决定细胞是否发生凋亡，当bcl-2高表达时，比值上调，可形成bcl-2/bax异源二聚体，抑制细胞的凋亡；当bax高表达时，比值下调，可形成bcl-2/bax同源二聚体，导致细胞凋亡^[25-36]，所以bcl-2/bax比值可反映bcl-2和bax在细胞凋亡中的作用，比值升高，则抑制细胞凋亡，反之促进细胞凋亡。周晓慧等^[32]探讨黄芩茎叶总黄酮对纯化培养乳鼠心肌细胞缺氧/复氧诱导心肌细胞凋亡的影响及其作用机制，结果显示与正常对照组比较，模型组细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，Bcl-2蛋白降低，Bax蛋白升高，Bcl-2/Bax蛋白降低，差异均有显著性意义(P < 0.01)，与模型组比较，黄芩茎叶总黄酮各剂量组细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，Bcl-2蛋白升高，Bax降低，Bcl-2/Bax升高，差异均有显著性意义(P < 0.05，P < 0.01)，可见黄芩茎叶总黄酮对缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡有保护作用，可能是通过上调Bcl-2蛋白的表达，降低Bax蛋白的表达而发挥作用。

实验通过RT-PCR法检测缺血再灌注区心肌bax、bcl-2 mRNA，发现缺血再灌注使bcl-2的mRNA表达降低，bax的mRNA表达增多，使bcl-2/bax的比值明显降低，提示bcl-2和bax参与了缺血再灌注损伤过程中的心肌细胞凋亡调控；生黄合剂预处理组和缺血再灌注模型组比较心肌细胞凋亡指数及bax mRNA的表达水平降低，而bcl-2 mRNA的表达提高，bcl-2/bax比值升高，实验结果显示，大鼠心肌缺血再灌注损伤诱发的细胞凋亡可用生黄合剂进行有效预防，效果最为明显是生黄合剂高剂量组，其机制可能与提高抑凋亡基因bcl-2 mRNA的表达量、下调促凋亡基因bax mRNA的表达量，提高bcl-2/bax比值，从而起到抑制或阻断心肌细胞凋亡。

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