SiRNA沉默Sox-9基因调控骨骺干细胞的增殖及凋亡

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.008

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (40): 7068-7075.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.40.008

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

SiRNA沉默Sox-9基因调控骨骺干细胞的增殖及凋亡

陈少坚¹，郭风劲²，王春¹，宫晨²　

¹福建医科大学附属闽东医院骨科，福建省宁德市 355000；²华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北省武汉市 430030

出版日期:2013-10-01 发布日期:2013-10-31
通讯作者: 郭风劲，教授，博士生导师，华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，湖北省武汉市 430030 fjguo@tjh.tjmu.edu.cn
作者简介:陈少坚★，男，1984年生，福建省泉州市人，汉族，2010年华中科技大学同济医学院毕业，硕士，医师，主要从事骨外科临床工作。 ankycsj@163.com
基金资助:
国家自然科学基金资助项目(31070831)*

Effects of Sox-9 gene silenced by small interfering RNA on proliferation and apoptosis of epiphysis stem cells　

Chen Shao-jian¹, Guo Feng-jin², Wang Chun¹, Gong Chen²

¹Department of Orthopedics, Min Dong Hospital, Fujian Medical University, Ningde 355000, Fujian Province, China; ² Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China

Online:2013-10-01 Published:2013-10-31
Contact: Guo Feng-jin, Professor, Doctoral supervisor, Department of Orthopedics, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China fjguo@tjh.tjmu.edu.cn
About author:Chen Shao-jian★, Master, Physician, Department of Orthopedics, Min Dong Hospital, Fujian Medical University, Ningde 355000, Fujian Province, China ankycsj@163.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 31070831*

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前有研究表明，很多细胞生长因子可促进骨骺干细胞的增殖和分化，并且这种调控作用与Sox-9有密切的关系。
目的：观察小分子干扰RNA沉默Sox-9基因及对大鼠骨骺干细胞增殖、凋亡的影响。
方法：采用酶消化法分离、免疫磁珠法纯化及免疫组织化学SABC法鉴定得到大鼠骨骺干细胞，首先进行预转染Sox-9 siRNA，判断转染效率，实验分2组：对照组常规培养，实验组采用Sox-9 siRNA转染。
结果与结论：实验成功分离、纯化了原代骨骺干细胞，生长状态稳定、贴壁牢固，光学显微镜下细胞多呈梭形。免疫组织化学染色和免疫荧光鉴定显示，Sox-9 siRNA转染的大鼠骨骺干细胞可稳定表达相对特异性标志物成纤维细胞生长因子受体3。RT-PCR，MTT，流式细胞仪检测检结果提示，与对照组相比，实验组Sox-9 mRNA表达及细胞存活率降低(P < 0.05)，凋亡率增加(P < 0.05)。结果证实，siRNA沉默Sox-9基因可调控大鼠骨骺干细胞的增殖和凋亡。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 软骨组织工程, 干细胞, 骨骺干细胞, siRNA干扰, Sox-9基因, 增殖, 凋亡, 细胞调控, 关节软骨修复, 国家自然科学基金, 干细胞图片文章　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

Abstract:

BACKGROUND: Current research has shown that many cell growth factors can promote the proliferation and differentiation of epiphysis stem cells, and this regulation is closely related to Sox-9.
OBJECTIVE: To investigate the effects of small interfering RNA-induced specific silence of Sox-9 gene on the proliferation and apoptosis of epiphysis stem cells.
METHODS: Epiphysis stem cells were isolated from the ring of La Croix with enzyme digestion and purified with magnetic activated cell sorting, identified by immunocytochemistry assay. The cells in good conditions were selected to be transfected by Sox-9 silenced by small interfering RNA with fluorescent marker, and then were observed under the fluorescent microscope to check the transfection efficiency. Next step, epiphysis stem cells were divided into 2 groups: group one was cultured normally as control group; group two was transfected by Sox-9 silenced by small interfering RNA through Lipofectamine^TM 2000 as experimental group.
RESULTS AND CONCLUSION: The primary epiphysis stem cells were separated and purified, which were of stable growth and tightly attachment. The results of immunohistochemistry and immunofluorescence showed the epiphysis stem cells expressed cell-specific markers, fibroblast growth factor receptor 3. After transfection, reverse transcription-PCR results showed that Sox-9 gene expression in epiphysis stem cell was inhibited specifically; 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide results showed that cell proliferation in experimental group decreased significantly compared with the control group (P < 0.05), and the cell apoptosis detected by flow cytometry showed that the experimental group increased as compared with the control group (P < 0.05). Sox-9 gene plays an important role in regulating the proliferation and apoptosis of rat epiphysis stem cells.

Key words: epiphyses, stem cells, biology, chondrocytes, cartilage

中图分类号:

R394.2

陈少坚，郭风劲，王春，宫晨. SiRNA沉默Sox-9基因调控骨骺干细胞的增殖及凋亡[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(40): 7068-7075.

Chen Shao-jian, Guo Feng-jin, Wang Chun, Gong Chen. Effects of Sox-9 gene silenced by small interfering RNA on proliferation and apoptosis of epiphysis stem cells　[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(40): 7068-7075.

图/表（结果） 6

2.1 大鼠骨骺干细胞的鉴定结果 在倒置相差显微镜下，观察纯化的原代骨骺干细胞可见：贴壁牢固、细胞多呈为短梭形或多角形、胞浆丰富、胞体光滑、折光性强，见图1。通过加入成纤维细胞生长因子受体3抗体，用免疫组织化学(SABC免疫细胞化学法)检测可见骨骺干细胞能稳定表达成纤维细胞生长因子受体3，见图2。

2.2 Sox-9 siRNA预转染结果 转染后继续细胞培养 72 h，并在镜下观察细胞分化形态改变，可以看到细胞未进行明显分化，仍呈现胞浆丰富、胞体光滑、折光性强，见图3。

同时FAM荧光测定结果显示，实验组转染效率在80%以上，达到转染干预的要求，可以做后续实验，见图4。

2.3 转染Sox-9 siRNA后72 h大鼠骨骺干细胞Sox-9基因的表达 转染Sox-9 siRNA后72 h，阳性条带以Gel Pro 4.0版凝胶光密度分析软件进行相关指标分析，测得平均吸光度值，Sox-9基因相对表达量实验组和对照组分别是0.598和0.437，Sox-9基因相对表达量实验组较对照组表达减少明显(P < 0.01)，提示Sox-9 siRNA通过Lipofectamine^TM 2000转染骨骺干细胞，可抑制阻断Sox-9基因的表达，见图5。

2.4 转染Sox-9 siRNA后72 h大鼠骨骺干细胞的增殖情况 转染后72 h，实验组的MTT值较对照组小，结果表明Sox-9 siRNA干扰骨骺干细胞后抑制其细胞增殖，见图6。

2.5 转染Sox-9 siRNA后72 h大鼠骨骺干细胞的凋亡 实验组细胞凋亡率明显高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

参考文献

[1]Ahmed TA, Hincke MT. Strategies for articular cartilage lesion repair and functional restoration. Tissue Eng Part B Rev. 2010; 16(3):305-329.
[2]Peretti GM, Pozzi A, Ballis R, et al. Current surgical options for articular cartilage repair. Acta Neurochir Suppl. 2011;108: 213-219.
[3]巩清波.关节软骨的损伤及其修复现状[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(24):4491-4494.
[4]Stoltz JF, Huselstein C, Schiavi J, et al. Human stem cells and articular cartilage tissue engineering. Curr Pharm Biotechnol. 2012;13(15):2682-2691.
[5]Fini M, Pagani S, Giavaresi G, et al. Functional tissue engineering in articular cartilage repair: is there a role for electromagnetic biophysical stimulation. Tissue Eng Part B Rev. 2013;19(4):353-367.
[6]Johnstone B, Alini M, Cucchiarini M, et al. Tissue engineering for articular cartilage repair--the state of the art. Eur Cell Mater. 2013;25:248-267.
[7]Muhammad H, Schminke B, Miosge N. Current concepts in stem cell therapy for articular cartilage repair. Expert Opin Biol Ther. 2013;13(4):541-548.
[8]赖建明,林建华.基因修饰骨髓间充质干细胞修复关节软骨损伤[J].中国组织工程研究,2013,(6):1107-1110.
[9]罗文,范建楠,叶川.软骨组织工程学方法修复关节软骨缺损[J].中国组织工程研究,2012,16(37):7009-7014.
[10]程越,田京.纳米支架与关节软骨重建[J].中国组织工程研究, 2012, 16(12):2265-2269.
[11]Luo W, Fan J, Ye C. Proliferation and chondrogenic differentiation of precartilaginous stem cells in self-assembling peptide nanofiber scaffolds. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi. 2012;26(12):1505-1511.
[12]You H, Chen A, Liu T, et al. Construction of eukaryotic expression plasmid of hTGF-beta3 and its inducing effect on differentiation of precartilaginous stem cells into chondroblasts. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2011;31(4):524-529.
[13]赵友,尹航,王昌兴,等.骨骺干细胞研究现状[J].中华中医药学刊, 2012,(2):346-348.
[14]Pan YS, Ding GX, Wang J. Research on repair strategies for articular cartilage defects. Zhongguo Gu Shang. 2013;26(2): 175-178.
[15]Akiyama H. Transcriptional regulation in chondrogenesis by Sox-9. Clin Calcium. 2011;21(6):845-851.
[16]Tew SR, Clegg PD. Analysis of post transcriptional regulation of SOX-9 mRNA during in vitro chondrogenesis. Tissue Eng Part A. 2011;17(13-14):1801-1807.
[17]Chen S, Tao J, Bae Y, et al. Notch gain of function inhibits chondrocyte differentiation via Rbpj-dependent suppression of Sox-9. J Bone Miner Res. 2013;28(3): 649-659.
[18]Sugimoto Y, Takimoto A, Akiyama H, et al. Scx+/Sox-9+ progenitors contribute to the establishment of the junction between cartilage and tendon/ligament. Development. 2013; 140(11):2280-2288.
[19]Cao L, Yang F, Liu G, et al. The promotion of cartilage defect repair using adenovirus mediated Sox-9 gene transfer of rabbit bone marrow mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2011;32(16):3910-3920.
[20]The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals. 2006-09-30.
[21]张衣北,陈安民,郭风劲,等.骨骺干细胞的体外培养及生长特性[J].中国康复,2006;21(1):3-5.
[22]游洪波,程浩.免疫磁性细胞分选技术分离纯化新生大鼠骨骺前软骨干细胞[J].中华创伤杂志,2004,20(10):33-35.
[23]Hu WH, Guo FJ, Li F, et al. Construction of Sox-9 gene eukaryotic expression vector and its inductive effects on directed differentiation of bone marrow stromal cells into precartilaginous stem cells in rats. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2009;(3):291-295.
[24]Hunziker EB, Rosenberg LC. Repair of partial-thickness defects in articular cartilage: cell recruitment from the synovial membrane. J Bone Joint Surg Am. 1996;78(5):721-733.
[25]Gobbi A, Kon E, Berruto M, et al. Patellofemoral full-thickness chondral defects treated with second-generation autologous chondrocyte implantation: results at 5 years' follow-up. Am J Sports Med. 2009;37(6):1083-1092.
[26]Hamanishi M, Nakasa T, Kamei N, et al. Treatment of cartilage defects by subchondral drilling combined with covering with atelocollagen membrane induces osteogenesis in a rat model. J Orthop Sci. 2013;19(4):353-367.
[27]Gao SJ, Wei JC, Lu B, et al. Experimental research on repairing full-thickness articular cartilage defects by transplantation of autologous uncultured bone-marrow- derived mononuclear cells in combination with micro-fracture. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2012;92(35):2463-2467.
[28]Chahal J, Gross AE, Gross C, et al. Outcomes of osteochondral allograft transplantation in the knee. Arthroscopy. 2013;29(3):575-588.
[29]Zhang L, Hu J, Athanasiou KA. The role of tissue engineering in articular cartilage repair and regeneration. Crit Rev Biomed Eng. 2009;37(1-2):1-57.
[30]Guilak F, Butler DL, Goldstein SA. Functional tissue engineering: the role of biomechanics in articular cartilage repair. Clin Orthop Relat Res. 2001;(391 Suppl):S295-S305.
[31]El Sayed K, Marzahn U, John T, et al. PGA-associated heterotopic chondrocyte cocultures: implications of nasoseptal and auricular chondrocytes in articular cartilage repair. J Tissue Eng Regen Med. 2013;7(1):61-72.
[32]Singh M, Sandhu B, Scurto A, et al. Microsphere-based scaffolds for cartilage tissue engineering: using subcritical CO(2) as a sintering agent. Acta Biomater. 2010;6(1):137-143.
[33]Raub CB, Hsu SC, Chan EF, et al. Microstructural remodeling of articular cartilage following defect repair by osteochondral autograft transfer. Osteoarthritis Cartilage. 2013;21(6):860- 868.
[34]Zhao Q, Wang S, Tian J, et al. Combination of bone marrow concentrate and PGA scaffolds enhance bone marrow stimulation in rabbit articular cartilage repair. J Mater Sci Mater Med. 2013;24(3):793-801.
[35]Leijten JC, Georgi N, Wu L, et al. Cell sources for articular cartilage repair strategies: shifting from monocultures to cocultures. Tissue Eng Part B Rev. 2013;19(1):31-40.
[36]Kamei G, Kobayashi T, Ohkawa S, et al. Articular cartilage repair with magnetic mesenchymal stem cells. Am J Sports Med. 2013;41(6):1255-1264.
[37]Robinson D, Hasharoni A, Cohen N, et al. Fibroblast growth factor receptor-3 as a marker for precartilaginous stem cells. Clin Orthop Relat Res. 1999;(367 Suppl):S163-175.
[38]Cheng H, Chen AM , You HB. immunomagnetic indirect positive sorting of precartilaginous stem cells from neonatal rat. Huazhong Keji Daxue Xuebao (Yixue Yingdewen Ban). 2006;(6):723-724.
[39]丁然,张勇,游洪波,等.人转化生长因子β3基因转染KLD-12自组装纳米肽纤维支架三维培养前软骨干细胞[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(29):5339-5343.
[40]You HB, Chen AM, Liu T, et al. Construction of eukaryotic expression plasmid of htgf-β3 and its inducing effect on differentiation of precartilaginous stem cells into chondroblasts. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci. 2011;31(4):524-529.
[41]You HB. Chondrogenesis of precartilaginous stem cells in KLD-12 self-assembling peptide nanofiber scaffold loading TGF-β3 gene. Wuhan Ligong Daxue Xuebao:Cailiao Kexueban. 2011;(4):634-640.
[42]胡伟华,郭风劲,陈安民,等.新生大鼠前软骨干细胞株的体外培养分选、鉴定及永生化研究(英文)[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(43):8588-8592.
[43]张衣北,陈安民,郭风劲,等.Notch1信号系统对骨骺干细胞增殖与分化调控作用的初步观察[J].中华医学杂志,2005,85(48): 3430-3434.
[44]周治国,李丽,郭风劲.甲状旁腺相关肽调控骨骺干细胞后的stathmin表达[J].生物骨科材料与临床研究,2010,7(1):10- 15.
[45]赵守军,熊文化,郭宁峰.乏氧环境下骨骺干细胞株在软骨载体中的相容性、增殖和分化成软骨的实验研究[J].现代实用医学, 2012,24(4):375-377.
[46]Kupcsik L, Stoddart MJ, Li Z, et al. Improving chondrogenesis: potential and limitations of SOX-9 gene transfer and mechanical stimulation for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part A. 2010;16(6):1845-1855.
[47]Hattori T, Muller C, Gebhard S, et al. SOX-9 is a major negative regulator of cartilage vascularization, bone marrow formation and endochondral ossification. Development. 2010; 137(6):901-911.
[48]Nakamura Y, He X, Kato H, et al. Sox-9 is upstream of microRNA-140 in cartilage. Appl Biochem Biotechnol. 2012; 166(1):64-71.
[49]Martinez-Sanchez A, Dudek KA, Murphy CL. Regulation of human chondrocyte function through direct inhibition of cartilage master regulator SOX-9 by microRNA-145 (miRNA-145). J Biol Chem. 2012;287(2):916-924.
[50]Park J, Zhang JJ, Moro A, et al. Regulation of Sox-9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 2010;239(2):514-526.
[51]Fanburg-Smith JC, Auerbach A, Marwaha JS, et al. Reappraisal of mesenchymal chondrosarcoma: novel morphologic observations of the hyaline cartilage and endochondral ossification and beta-catenin, Sox-9, and osteocalcin immunostaining of 22 cases. Hum Pathol. 2010; 41(5):653-662.
[52]Cucchiarini M, Terwilliger EF, Kohn D, et al. Remodelling of human osteoarthritic cartilage by FGF-2, alone or combined with Sox9 via rAAV gene transfer. J Cell Mol Med. 2009; 13(8B): 2476-2488.
[53]张伟凯,陈安民,郭风劲,等.大鼠骨骺干细胞免疫纯化和Sox-9基因真核表达载体的克隆构建[J].中国组织工程研究与临床康复,2008,12(12):2321-2325.
[54]张树威,金伟,祝少博,等.甲状旁腺素相关蛋白亚基因对骨骺干细胞的调控[J].中国组织工程研究,2013,17(10):1814-1820.
[55]Cucchiarini M, Orth P, Madry H. Direct rAAV SOX-9 administration for durable articular cartilage repair with delayed terminal differentiation and hypertrophy in vivo. J Mol Med (Berl). 2013;91(5):625-636.

引言

关节运动创伤或炎症、退变性疾病造成的关节软骨损伤在骨科临床上十分常见，它可形成创伤性关节炎，使患者出现关节反复肿胀、疼痛，严重者关节畸形等功能障碍。关节软骨由于缺乏血管供应，主要营养来自关节周围的滑液，关节软骨自身修复能力有限，特别是成熟关节软骨修复能力极为有限^[1] 。因此，损伤软骨的修复已成为骨科临床治疗的一个难题。传统常规的关节软骨修复方法^[2-3] ，包括：关节镜下微骨折修复、骨软骨移植等，一般只能缓解关节疼痛、改善关节功能、延缓关节退变进程，临床疗效有限。随着组织工程材料学、分子生物学等学科的快速发展，基于细胞移植和新型支架材料的软骨组织工程已经成为当前研究解决关节软骨损伤的热门领域^[4-10] 。
除了常见的骨髓间充质干细胞外，近年来研究证明骨骺干细胞亦可作为一种较理想的软骨组织工程种子细胞^[11-13] ，有多种细胞因子及力学等外界刺激可促进其增殖，修复软骨损伤。但目前的问题在于细胞增殖过度和不适当的凋亡均会影响具有增殖分化功能的骨骺干细胞在人体内的生物安全性^[14] 。Sox-9 (SRY-related high mobility group-box gene 9)基因作为一个重要的转录激活因子，以往相关研究已证明其在软骨形成中起着极其重要的调控作用^[15-19] 。
因此，实验设想通过Sox-9基因干预可以对骨骺干细胞的增殖、凋亡进行相对精确的调控，从而提高其在体内的生物安全性。实验拟用siRNA转染沉默Sox-9基因，观察其转染效率及对骨骺干细胞增殖、凋亡的影响，初步揭示相关的作用机制，为研究通过Sox-9基因精确调控骨骺干细胞以用于软骨组织工程促进对关节软骨损伤修复奠定实验基础。

材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：于2009年10月至2010年3月于华中科技大学同济医学矫形外科实验室完成。

材料：

实验动物：健康纯系清洁级出生24 h内的SD大鼠12只，SPF级，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供，动物许可证号：SCXX(鄂)2009-0010。

实验对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》^[20]。

实验方法：

大鼠骨骺干细胞的分离、纯化与鉴定：参考张衣北等^[21]的方法，在显微解剖镜下，剪下SD大鼠股骨骨干与骨骺部结合处两侧的骨膜环(La Croix环)并剪碎，体积分数0.25%胰酶消化5 min，D-Hanks液重悬细胞，再加入0.1%的胶原酶溶液(由培养基配制)重悬细胞，将悬浮液移入培养瓶中，于37 ℃、饱和湿度、体积分数5%CO₂培养箱中消化过夜后，接种于(含体积分数10%FBS) DMEM/F12培养基中继续培养。

待细胞融合至80%-90%，按照游洪波等^[22]的方法通过1 mL磁珠Buffer溶液重悬细胞，加入10 μL兔多克隆抗体成纤维细胞生长因子受体3(c-15)，离心、清洗并弃上清后，再用500 μL磁珠Buffer溶液重悬细胞，加入 10 μL带羊抗兔IgG的免疫磁珠，用miniMACS系统磁性细胞分选仪纯化得到骨骺干细胞。

取第2代骨骺干细胞胰酶消化进行细胞爬片，爬满50%-60%时，40 g/L多聚甲醛固定30 min，Triton-X100破膜20 min。应用SABC免疫细胞化学法，按照试剂盒说明书步骤进行成纤维细胞生长因子受体3抗体染色，DAB显色，并在光学显微镜下观察细胞形态及深染的细胞。

Sox-9 siRNA预转染确定转染效率：转染前1 d，选择(3-5)×10⁵细胞接种在6孔培养板上，加入2 mL培养基，观察细胞选择适于初期接种的细胞数量，应能在24 h内使细胞融合度达到50%-60%，按照产品说明书配制Sox-9 siRNA-Lipofectamine^TM 2000复合物，弃去培养板旧的培养液，用1 mL无血清DMEM培养液洗涤细胞1次弃去，再向每孔中加入1 mL Sox-9 siRNA- Lipofectamine^TM 2000复合物，轻轻摇动充分混合，继续培养，直到适合分析。计算转染率的方法，在普通光镜图片上计数所有细胞，FAM(6-羧基荧光素)标记后在荧光镜图片上计数荧光细胞数量，转染率=荧光细胞数量/所有细胞数量×100%，siRNA载体转染率达到80%以上达到转染干预的要求。可做下游分析与检测。

Sox-9-siRNA转染：实验分2组，对照组常规培养，实验组用Sox-9-siRNA转染。转染前1 d，接种适当数量的细胞至细胞培养板中，使转染时的细胞密度能够达到50%。按如下步骤准备Sox-9 siRNA-Lipofectamine^TM 2000混合液：稀释转染试剂Lipofectamine^TM 2000，使用前，将Lipofectamine^TM 2000转染试剂轻轻摇匀，然后取250 μL Opti-MEM^® I稀释5 μL Lipofectamine^TM 2000复合物，轻轻混和，室温孵育5 min；稀释 Sox-9 siRNA：用250 μL Opti-MEM^® I稀释7.5 μL Sox-9 siRNA，轻轻混和；将稀释好的Lipofectamine™ 2000复合物经过5 min的孵育后，与上述稀释好的Sox-9 siRNA轻轻混和，室温培养20 min以形成Sox-9 siRNA- Lipofectamine^TM2000混和物。将Sox-9 siRNA- Lipofectamine^TM 2000混合液，转染浓度是50 nmol/L，加入含有细胞以及培养液的细胞培养板中，轻轻摇晃，使之混和，将培养板置于37 ℃的CO₂培养箱中培养。分组实验操作后继续培养，于培养24，48，72 h用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测细胞增殖情况，于培养后72 h用RT-PCR检测Sox-9基因表达水平、流式技术 Annexin_V-FITC&PI 进行凋亡检测。

RT-PCR检测大鼠骨骺干细胞Sox-9基因的表达：在干预并培养72 h后，根据Trizol Reagent说明书及胡伟华等^[23]的方法提取总RNA，然后进一步反转录。根据Gene Bank大鼠基因序列设计，引物由上海Invitrogen公司合成。

Sox-9的PCR反应条件：94 ℃预变性 5 min，然后进入32个循环：94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后72 ℃延伸5 min。内参β-actin的PCR反应条件为：94 ℃预变性 5 min，然后进入26个循环：94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，最后72 ℃延伸5 min。反应产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性条带以Gel pro 4.0版凝胶光密度分析软件进行相关指标分析，测其吸光度值。

四甲基偶氮唑蓝法检测转染后大鼠骨骺干细胞的增殖：干预完成后24，48，72 h分别取细胞，用MTT法检测，将酶标仪设置在A_{570 nm}波长处检测每孔的A值。根据所得数据绘制图表进行结果分析：细胞的存活率计算：将各测试孔的吸光度值减去本底的吸光度值或空白药物孔吸光度值，各重复孔的吸光度值取平均值。以T/C%表示细胞存活率，其中T为加药细胞孔的吸光度值，C为对照细胞的A值。

流式细胞仪技术检测转染后大鼠骨骺干细胞的凋亡：细胞转染后继续培养72 h，胰酶消化收集细胞后用预冷PBS重悬洗涤细胞，按说明书配制Binding Buffer和Annexin_V标记液，接着用标记液轻轻重悬细胞，控制细胞量为10⁵-10⁶细胞/100 μL孵育液，在暗室内室温下孵育15 min，再加入PI，每100 μL孵育液中加预冷的400 μL Binding Buffer稀释，15 min内进行流式检测。流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515 nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI染色产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI^-)；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC⁺/PI⁺)；而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC⁺/PI^-)。由此计算细胞凋亡率=(凋亡细胞数量/正常细胞数量)×100%。

主要观察指标：骨骺干细胞的细胞形态，转染后细胞中成纤维细胞生长因子受体3的表达，细胞增殖能力，细胞凋亡率。

统计学分析：计量资料以x(_)±s表示，由第一作者采用SPSS 15.0统计软件进行数据分析，组间均数差异的比较采用两样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

关节软骨损伤在临床上十分常见，且自我修复能力有限，损伤软骨的修复已成为骨科临床治疗的一个难题。软骨损伤临床上分为2种：轻度为部分厚度缺损(Partial Thickness Defects)，重度为全层缺损(Full Thickness Defects)。此2种缺损自身修复过程并不尽相同，因为部分厚度缺损不侵及软骨下基质，无明显激骨髓中的祖细胞，其主要是通过周围的滑膜细胞修复缺损^[24] 。而全层缺损到软骨下基质，可由骨髓基质干细胞增殖、分化形成纤维软骨组织，关节镜下软骨下钻孔术主要的原理也是通过接触骨髓基质干细胞修复软骨，然而远期观察发现修复的组织容易出现明显的退变。最新的研究发现用自身软骨细胞移植修复全层缺损可形成透明样软骨^[25] 。传统常规关节软骨修复方法包括：关节镜下软骨下钻孔术^[26] 、微骨折术和骨软骨移植等^[27-28] ，但修复软骨损伤效果有限。
近年来随着组织工程学的快速发展，基于细胞移植的软骨组织工程具有良好应用前景^{[5, 29-34]} ，骨骺干细胞可作为较理想的种子细胞。软骨组织工程的主要内容为：获取种子细胞在体外进行培养扩增后，接种到有良好的细胞生物相容性、可控制的降解率并具有一定力学强度的细胞支架材料上，并可在支架材料上附有软骨生长和基质合成所需要的具有可调控的细胞生物因子，在适当力学刺激的生物环境中继续培养后，将这复合物植入到体内软骨损伤缺损部位，支架材料可逐渐被降解吸收而种子细胞在细胞因子刺激下经过适当的增殖和分化，形成新的软骨组织以修复软骨缺损。软骨组织工程目前存在种子细胞来源较少^[35-36] 。
Robinson等^[37]于1999年研究发现在骨骺La Croix环周围软骨膜间质中存在一种成纤维细胞生长因子受体3染色阳性的细胞，具有较高的细胞增殖能力和向软骨定向分化的能力，显示出干细胞特性，称为前软骨干细胞或骨骺干细胞。张衣北等^[21]较早在用酶消化分离和 Percoll 密度梯度离心法纯化得到骨骺干细胞，并进行体外培养，进一步观察其生长特性。以往有相关研究根据细胞表面相对特异性标志物成纤维细胞生长因子受体3利用免疫珠分选技术分离纯化获得高度纯化、高成活率的骨骺干细胞^[38-42] ，同时显示骨骺干细胞在一定条件下可以向软骨细胞定向分化，可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。
骨骺干细胞体外扩增、凋亡和分化的调控作用机制复杂，仍不完全明确。张衣北等^[43]的研究显示Notch信号系统对骨骺干细胞的增殖、分化有调控作用，激活Notch信号系统可促进细胞增殖，而当Notch信号系统被抑制，则细胞进行分化。周治国等^[44]研究提示甲状旁腺相关肽及其肽段PTHrp(107-139)均可能有促进骨骺干细胞增殖的作用，stathmin在调控中出现高表达，提示细胞增殖。赵守军等^[45]研究发现，乏氧环境下缺氧诱导因子1能促进骨骺干细胞株的增殖、分化成软骨，其促进作用有一定的剂量依赖性。

Sox-9基因作为一个重要的转录激活因子，在骨骺干细胞增殖、凋亡及软骨分化过程中均起着非常重要的调控作用，相关的研究对软骨缺损损伤修复等组织再生工程发展具有十分重要的意义^[46] 。目前的一些研究结果已显示很多的细胞生长因子可促进干细胞的增殖、分化，并且这种调控与Sox-9有密切的关系^[47-52] ，这些生长因子可通过构建真核表达质粒转染进干细胞进行稳定表达促进增殖、分化，并可进一步联合新型材料支架用于软骨组织工程中修复软骨损伤。而相关的研究也显示Sox-9可以促进骨骺干细胞的增殖与成软骨分化^[53] ，张树威等^[54]研究显示PTHrP(107-139)可能是通过调控Sox-9、Ptc及骨形态发生蛋白6的表达来促进骨骺干细胞增殖并抑制其分化的。
然而目前需要解决的是如何对骨骺干细胞增殖、凋亡相对精确的调控，过度的增殖可产生成肿瘤特性，引起骨骺干细胞体内的生物安全问题。现有的研究大多侧重于促进骨骺干细胞的增殖^{[55 ]} ，并向软骨方向分化，对其增殖的适当抑制以免过度增殖引起生物安全问题，研究的仍较少，因此实验在前期的研究基础上找到Sox-9基因，通过干扰沉默以达到抑制骨骺干细胞增殖、促进凋亡的调控。
实验结果显示siRNA沉默Sox-9基因可对大鼠骨骺干细胞增殖、凋亡进行相对精确的调控。通过酶消化法分离、培养，并且利用细胞表面相对特异性标志物成纤维细胞生长因子受体3通过免疫磁珠分选技术可以很好地应用于该细胞的纯化，得到生长状态稳定的骨骺干细胞，同时通过免疫组织化学SABC法鉴定稳定表达成纤维细胞生长因子受体3的骨骺干细胞。并通过Lipofectamine^TM2000预转染Sox-9-siRNA，检测发现转染效率较高，并通过RT-PCR检测Sox-9 mRNA表达，发现可有效抑制Sox-9基因表达，达到沉默效果。进一步通过分组干预实验继续培养72 h，用MTT检测结果提示，沉默Sox-9基因后细胞增殖降低，流式技术检结果提示，细胞调亡增加。
实验在体外通过Lipofectamine^TM 2000转染Sox-9-siRNA沉默Sox-9基因，并进而调控骨骺干细胞的增殖和调亡，对骨骺干细胞在体外培养时的相关调控分子机制进行了初步探讨，为进一步研究骨骺干细胞作为种子细胞用于体内细胞移植修复软骨缺损等软骨组织工程奠定基础。
目前存在的不足是在骨骺干细胞中沉默Sox-9基因的调控作用与重要的Ihh/PTHrP负反馈信号轴的作用关系及骨骺干细胞分化的影响仍不明确，将在后续实验中进一步深入研究。

SiRNA沉默Sox-9基因调控骨骺干细胞的增殖及凋亡

Effects of Sox-9 gene silenced by small interfering RNA on proliferation and apoptosis of epiphysis stem cells

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[1]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[4]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[5]	田川, 朱向情, 杨再玲, 鄢东海, 李晔, 王严影, 杨育坤, 何洁, 吕冠柯, 蔡学敏, 舒丽萍, 何志旭, 潘兴华. 骨髓间充质干细胞调控猕猴卵巢的衰老[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 985-991.
[6]	胡伟, 谢兴奇, 屠冠军. 骨髓间充质干细胞来源外泌体改善脊髓损伤后血脊髓屏障的完整性[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 992-998.
[7]	惠小珊, 白京, 周思远, 王阶, 张金生, 何庆勇, 孟培培. 中医药调控干细胞诱导分化的理论机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1125-1129.
[8]	侯婧瑛, 郭天柱, 于萌蕾, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理通过激活MALAT1靶向抑制miR-195促进骨髓间充质干细胞的生存和血管形成[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1005-1011.
[9]	周颖, 张幻, 廖松, 胡凡琦, 易静, 刘玉斌, 靳继德. 去铁胺联合干扰素γ预处理对人牙髓干细胞的免疫调节作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1012-1019.
[10]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[11]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[12]	刘峰, 彭宇环, 罗良平, 吴本清. 植物源性碱性成纤维细胞生长因子维持人胚胎干细胞的生长与分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1032-1037.
[13]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[14]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[15]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.